關中奶山羊BAC文庫構建及其利用Red系統(tǒng)同源重組的研究.pdf

1、一種新型的載體系統(tǒng)——細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome,BAC)已經(jīng)發(fā)展成為構建復雜基因組文庫的重要方法.BAC文庫在基因組研究中起著關鍵作用,對BAC的修飾在分析和研究基因體內和體外的功能和表達方面也有很重要的作用.利用Red系統(tǒng)進行的基因同源重組技術擴展了BAC文庫的應用范圍,并為轉基因動物研究克服轉基因表達的"位置效應"提供了新的思路.該研究的目的就是構建具有高產(chǎn)奶性能的關中奶山羊基因

2、組DNA的BAC文庫,及利用Red重組系統(tǒng)將天然的人組織型纖溶酶原激活劑(ht-PA)的編碼序列置換掉BAC克隆中的β-酪蛋白的編碼序列,用β-酪蛋白的調控序列指導ht-PA的表達,以消除轉基因動物外源基因的"位置效應",為制備表達ht-PA的動物乳腺生物反應器提供一個有效的載體.該論文由2部分組成:1.用脈沖電泳技術分離大片段DNA,以電透析法回收DNA后,與用BamHI酶切和CIAP(牛小腸堿性磷酸酶)脫磷的pBeloBAC11載體

3、連接,然后電擊轉化感受態(tài)細胞DH10B,得到了關中奶山羊基因組的部分BAC文庫,插入片段平均大小為30~40kb.摸索了BAC載體制備、高分子量DNA制備、酶切、連接和電擊轉化等一系列環(huán)節(jié)對高效轉化產(chǎn)生大片段DNA的BAC的影響,為整個文庫的構建奠定了基礎.2.構建了兩個攜帶Zeocin抗性的ht-PA的載體,一個含有牛生長激素polyA信號(Bovine growth hormone polyadenylation signal,BG