遺傳性疾病的試驗(yàn)診斷

1、出生缺陷篩查與遺傳性疾病的實(shí)驗(yàn)診斷,上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院樊綺詩(shī),遺傳性疾病的分類,染色體?。涸谏臣?xì)胞發(fā)生和受精卵早期發(fā)育過(guò)程中發(fā)生差錯(cuò)，產(chǎn)生整條染色體或染色體節(jié)段超過(guò)或少于二倍體數(shù)，表現(xiàn)出先天發(fā)育異常單基因?。浩鹨蛴谥虏』?，在一對(duì)同源染色體上可能其中一條帶有突變基因，也可能同源染色體上的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)都是突變基因。有特征性家系傳遞格局,遺傳性疾病的分類,多基因?。阂喾Q多因子病，起因于遺傳素質(zhì)和環(huán)境因素，包括一些先天性發(fā)育

2、異常和常見病線粒體遺傳?。壕€粒體基因突變可導(dǎo)致線粒體遺傳病，隨線粒體傳遞，呈細(xì)胞質(zhì)遺傳體細(xì)胞遺傳?。喊┠[起因于體細(xì)胞遺傳物質(zhì)的突變，可表現(xiàn)出家族性癌腫遺傳易感性。有些先天畸形亦屬此類。,單基因遺傳病的分類,常染色體連鎖遺傳性疾?。褐虏』蛭挥诔Ｈ旧w性染色體連鎖遺傳性疾?。褐虏』蛭挥谛匀旧w,常染色體連鎖遺傳性疾病,常染色體連鎖隱性遺傳位于一對(duì)常染色體上的兩個(gè)等位基因均發(fā)生突變才能產(chǎn)生臨床癥狀，此時(shí)所導(dǎo)致的相應(yīng)疾病稱為常染色

3、體連鎖隱性遺傳性疾病同一對(duì)染色體中只有一個(gè)等位基因發(fā)生突變的個(gè)體稱為雜合子，二個(gè)等位基因均發(fā)生突變的個(gè)體稱為純合子囊性纖維變：常染色體連鎖隱性遺傳(7q31),常染色體連鎖遺傳性疾病,常染色體連鎖顯性遺傳位于一對(duì)常染色體上的二個(gè)等位基因之一發(fā)生突變即產(chǎn)生臨床癥狀，所導(dǎo)致的相應(yīng)疾病稱為常染色體連鎖顯性遺傳性疾病特點(diǎn)：家系中患者數(shù)目較多，大多情況下每一代均有患者Huntington舞蹈癥：常染色體顯性遺傳(4p16.3),性染色體

4、連鎖遺傳性疾病,X染色體連鎖遺傳大多為隱性遺傳 (如甲型血友病、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥)顯性遺傳非常罕見Y染色體連鎖遺傳,產(chǎn)前篩查（診斷）,在胎兒出生前對(duì)其出生缺陷（包括先天異常和宮內(nèi)感染）進(jìn)行檢查產(chǎn)前篩查包括實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、影像學(xué)檢查等圍產(chǎn)醫(yī)學(xué),產(chǎn)前篩查的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),染色體病的實(shí)驗(yàn)室篩查胎兒宮內(nèi)感染的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)遺傳性疾病的基因檢測(cè),,染色體病的實(shí)驗(yàn)室篩查,,孕早期篩查（孕7～11周）孕中期篩查（孕15～20周）產(chǎn)前篩查只是對(duì)

5、胎兒罹患某一先天性或遺傳性疾病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估而非確診,中國(guó)出生缺陷現(xiàn)狀,中國(guó)每年約有100萬(wàn)缺陷兒出生，其中只有30%可以治愈或糾正全國(guó)累計(jì)近3000萬(wàn)個(gè)家庭曾生育過(guò)出生缺陷和先天殘疾兒，占全國(guó)家庭總數(shù)1/10中國(guó)每年出生約3-5萬(wàn)唐氏兒，10萬(wàn)神經(jīng)管缺陷患兒,,造成沉重的社會(huì)負(fù)擔(dān)和精神壓力此項(xiàng)支出每年達(dá)到300億每個(gè)唐氏患兒僅醫(yī)藥費(fèi)支出就達(dá)25萬(wàn)1個(gè)患兒平均累及7個(gè)成人,關(guān)鍵在于預(yù)防,三級(jí)預(yù)防可大幅度減少出生缺陷兒的發(fā)生1級(jí)：

6、孕前保健2級(jí)：孕期保健(產(chǎn)前篩查與診斷)3級(jí)：新生兒篩查(早發(fā)現(xiàn)早干預(yù)),篩查指征,危害嚴(yán)重發(fā)病率較高，人群分布明確篩查陽(yáng)性有進(jìn)一步明確診斷方法篩查方法較簡(jiǎn)易篩查費(fèi)用明顯低于治療費(fèi)用,孕期保健篩查的主要疾病,21-三體綜合癥，發(fā)病率為1/700~1/80018-三體綜合癥，發(fā)病率1/6000~1/8000開放性神經(jīng)管缺陷，發(fā)病率1/1000~1/2000,新生兒篩查的主要疾病,先天性甲狀腺功能低下苯丙酮尿癥先天性腎上

7、腺皮質(zhì)增生癥葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏采集一滴新生兒足跟末梢靜脈血于濾紙上，干燥后運(yùn)輸至篩查中心統(tǒng)一檢測(cè)。,血清學(xué)篩查的基本概念,安全性抽取孕婦 2ml靜脈血，通過(guò)測(cè)定血清中的特定標(biāo)志物，間接地判斷胎兒患遺傳缺陷疾病的風(fēng)險(xiǎn)度非創(chuàng)傷性篩查對(duì)象原則上為孕9-20+6周的所有孕婦,血清學(xué)篩查的基本概念,孕婦自愿孕婦接受產(chǎn)前篩查遵循自愿原則，明確產(chǎn)前篩查的內(nèi)容、意義和相應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)，并簽署產(chǎn)血清學(xué)前篩查知情同意書篩查與確診篩查 (高

8、危)病例，需進(jìn)一步做絨毛膜(孕早期)或羊水穿刺(孕中期)做染色體核型分析進(jìn)行確診。,年齡曾是唐氏綜合征產(chǎn)前篩查的指標(biāo),產(chǎn)前篩查的血清標(biāo)志物,1984年首次報(bào)道懷有染色體異常特別是DS胎兒的孕婦血清AFP水平偏低，建議將AFP作為35歲以下孕婦胎兒染色體異常的篩查指標(biāo)1987年報(bào)道懷有DS胎兒的母血中人絨毛膜促性腺激素（HCG）的水平是正常孕婦的2倍；非結(jié)合雌三醇（uE3）的水平比正常低25%，提示可以作為另兩個(gè)篩查指標(biāo)1991年報(bào)道

9、妊娠相關(guān)血漿蛋白A（ PAPP-A）與DS有關(guān)1996年，抑制素A (inhibin A)成為第四個(gè)血清檢測(cè)指標(biāo),,以上單個(gè)指標(biāo)進(jìn)行唐氏綜合征的篩查，檢出率均太低(30%左右)將AFP、HCG、uE3和Inhibin A四項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)稱為四聯(lián)篩查對(duì)14-20周的孕婦進(jìn)行篩查，檢出率為81%，假陽(yáng)性率約5%,,目前國(guó)內(nèi)孕中期血清學(xué)產(chǎn)前篩查模式 (Second-trimester maternal serum scre

10、ening) AFP + free βHCG/HCG AFP + free βHCG/HCG + uE3 AFP + free βHCG/HCG + uE3 + Inh A,全球篩查模式,我國(guó)開展篩查的現(xiàn)狀及可選方案,,我國(guó)開展現(xiàn)狀：對(duì)孕早期篩查的重要意義認(rèn)識(shí)不足，孕中期篩查仍為主流孕早期篩查技術(shù)不成熟，尤其規(guī)范NT檢測(cè)有相當(dāng)難度大多數(shù)孕婦孕中期才參加產(chǎn)前保健大多數(shù)中心僅限于傳統(tǒng)的中期兩項(xiàng)篩查產(chǎn)

11、篩質(zhì)量管理意識(shí)有待加強(qiáng),,針對(duì)我國(guó)國(guó)情推薦參考方案：積極宣傳孕早期篩查的重要意義，產(chǎn)篩未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)在不具備規(guī)范NT檢測(cè)情況下，建議進(jìn)行孕中期四聯(lián)篩查，使其成為國(guó)內(nèi)產(chǎn)篩的基礎(chǔ)性工作有條件的地區(qū)開展酌情、序貫或血清整合等多種模式篩查，為孕婦提供更多選擇,,胎兒宮內(nèi)感染的實(shí)驗(yàn)室檢查,TORCH綜合征的孕前和產(chǎn)前檢測(cè),TORCH綜合征是病原微生物感染引起胎兒異常的一組疾病 弓形蟲（toxoplasma, TOXO）

12、 風(fēng)疹病毒（rubella virus, RV） 巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus, CMV） 單純皰疹病毒（herpes simple virus, HSV） 其他病原微生物（other, O）,,孕婦為易感人群，感染途徑與一般人相同可發(fā)生在妊娠各期，宮內(nèi)感染可造成嚴(yán)重后果感染后除免疫缺陷者外，機(jī)體均產(chǎn)生特異性抗體。采集孕婦外周血檢測(cè)相關(guān)病原體的特異性抗體 Ig

13、G 和 IgM，以判斷孕婦是否曾經(jīng)或正在感染某一病原體,,抗體檢測(cè)：免疫學(xué)方法血清學(xué)檢測(cè)的局限性 抗體產(chǎn)生時(shí)間 判斷胎兒感染須謹(jǐn)慎 孕前篩查更為重要 免疫缺陷者可能檢測(cè)不到相應(yīng)抗體,,單基因遺傳病的基因診斷,單基因遺傳病中常見的分子異常,遺傳性疾病的產(chǎn)生是由于一個(gè)（或數(shù)個(gè)）基因發(fā)生異常導(dǎo)致這些基因所載有的遺傳信息受到改變，而發(fā)病是通過(guò)遺傳物質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)物——蛋白質(zhì)（或酶）的表現(xiàn)異常所致?；蛲蛔冎饕?/p>

14、點(diǎn)突變、片段性突變和動(dòng)態(tài)性突變。,點(diǎn)突變 (point mutation),包括錯(cuò)義突變、無(wú)義突變、移碼突變各種點(diǎn)突變所造成的后果： 蛋白質(zhì)分子量改變 蛋白質(zhì)合成量下降 無(wú)蛋白質(zhì)合成,,片段性突變(fragememtal mutation),核苷酸的丟失和增多缺失：基因中鹼基（遺傳物質(zhì)）的丟失插入：外來(lái)基因片段插入某一基因序列中倍增：基因內(nèi)部某一段序列發(fā)生重復(fù)基因重排：基因組中原來(lái)不在

15、一起的基因由于某些原因重新排列,動(dòng)態(tài)性突變(dynamic mutation),以三核苷酸為單位的重復(fù)序列在傳遞過(guò)程中 不穩(wěn)定，會(huì)發(fā)生擴(kuò)展，即子代的重復(fù)次數(shù)往 往較親代大為增加，因此又稱動(dòng)態(tài)性突變。 脆性X綜合征：CGG重復(fù) 少年脊髓型共濟(jì)失調(diào)：GAA重復(fù) 亨廷頓?。篊AG重復(fù),X染色體（xq27.3）的脆性位點(diǎn),脆性X綜合征是遺傳性智力缺陷最常見的一種。致病基因FMR-1的5’端有CGG三核苷

16、酸重復(fù) 區(qū)。普通男性群體中的患病率為1/4000。普通女性群體中的患病率為1/6000。患者智力低下、語(yǔ)言障礙、行為異常、呈特殊 面容。,正常個(gè)體：CGG重復(fù)次數(shù)6~52次，中國(guó)人群以(CGG)28為多見。前突變(premutation)： (CGG) 53~230為攜帶者，雖表型正常，但在傳遞過(guò)程中易發(fā)生進(jìn)一步擴(kuò)展，使后代的CGG重復(fù)次數(shù)大大增加，并有異常表型。全突變： (CGG) ≥230時(shí)，100%的男性表

17、現(xiàn)為典型的脆性X綜合征, 53%的女性表現(xiàn)為程度不同的智力低下。,遺傳性疾病基因診斷的策略,（一）直接診斷策略 基因診斷的直接策略是通過(guò)各種分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)基因的遺傳缺陷，因此直接診斷的前提是被檢測(cè)基因的正常序列和結(jié)構(gòu)必須被闡明。 直接診斷由于是直接揭示遺傳缺陷，因而比較可靠。,,直接診斷常用技術(shù),Southern 印跡技術(shù)將基因組DNA用限制性內(nèi)切酶水解，經(jīng)凝膠電泳分離用堿處理使凝膠中的DN

18、A變性為單鏈，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜或尼龍膜上用標(biāo)記的特異性探針與變性單鏈雜交，可使特異條帶顯影實(shí)驗(yàn)結(jié)果為限制性長(zhǎng)度片段多態(tài)性分析（restriction fragment length polymorphism, RFLP）,直接診斷常用技術(shù),聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）在突變點(diǎn)二側(cè)設(shè)計(jì)引物，經(jīng)擴(kuò)增后可得含有突變點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物以突變篩查技術(shù)找出突變點(diǎn)　 SSCP、DGGE

19、 Melting curve analysis DNA sequencing,DMD的基因檢測(cè),Duchenne muscular dystrophy (DMD) 是一種 高發(fā)病率、高致殘、高致死的X 連鎖的遺傳性疾病，平均每3500個(gè)活產(chǎn)男嬰中即有一個(gè)患者DMD基因的全長(zhǎng)為250kb，有79個(gè)外顯子DMD的最主要遺傳缺陷是外顯子缺失，約占突變的60%~70%用多重PCR技術(shù)對(duì)外顯子進(jìn)行篩查,DMD基因外顯子的檢測(cè)

20、,,（二）間接診斷策略,間接診斷是在家系中進(jìn)行連鎖分析，通過(guò)分析可確定個(gè)體來(lái)自雙親的同源染色體中的哪一條為致病染色體（與致病基因連鎖），從而判斷該個(gè)體是否帶有致病基因 間接診斷不是尋找DNA的遺傳缺陷，而是通過(guò)分析DNA的遺傳標(biāo)志的多態(tài)性估計(jì)被檢者患病的可能性,遺傳標(biāo)志及其多態(tài)性,單拷貝序列在基因組中僅出現(xiàn)一次或少數(shù)幾次，大多數(shù)基因(50%~80%)在單倍體中都為單拷貝,重復(fù)序列,真核生物染色體DNA中存在許多不同程度

21、的重復(fù)序列，按照孟德爾遺傳定律傳遞大多存在于基因的非編碼區(qū)根據(jù)DNA序列重復(fù)出現(xiàn)頻率的不同而分為不同類型,,中度重復(fù)序列,短分散片段(short interspersed segments, SINEs)平均長(zhǎng)度300bp，拷貝數(shù)可達(dá)10萬(wàn)左右長(zhǎng)分散片段(long interspersed segments, LINEs)平均長(zhǎng)度3500~5000bp，拷貝數(shù)達(dá)1萬(wàn)左右在人類基因組中約占12%,中度重復(fù)序列,大多數(shù)不編碼蛋白質(zhì),

22、與單拷貝基因間隔排列有些是編碼蛋白質(zhì)或RNA的結(jié)構(gòu)基因（HLA、rRNA、tRNA、組蛋白、免疫球蛋白基因）可存在于結(jié)構(gòu)基因之間、基因簇之中、內(nèi)含子內(nèi)部,高度重復(fù)序列,存在于基因組的間隔區(qū)和基因的內(nèi)含子等非編碼區(qū)重復(fù)頻率可高達(dá)106 以上，不轉(zhuǎn)錄具高度多態(tài)性，成為有效的遺傳標(biāo)志，已廣泛用于基因定位和基因診斷,,小衛(wèi)星序列也稱數(shù)量可變的串聯(lián)重復(fù)序列(Variable Number of Tandem Repeat, VNTR)

23、以6-70bp為單位，可重復(fù)數(shù)次至數(shù)十次，以串聯(lián)形式排列,,微衛(wèi)星序列 (microsatellite)又稱短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)以2-6bp為單位，重復(fù)次數(shù)可達(dá)幾十次在基因組中出現(xiàn)的數(shù)目和頻率不同，分布廣泛，具高度多態(tài)性,,堿基組成不同于其他部分，用密度梯度離心可將其與主體DNA分開,重復(fù)序列的檢測(cè),PCR技術(shù)在重復(fù)序列二側(cè)設(shè)定引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增用凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)產(chǎn)物片段大小即可決定重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù),遺傳咨詢和

24、產(chǎn)前基因診斷,遺傳咨詢明確診斷先證者，確定引起疾病的分子異常了解本病傳遞至下代的風(fēng)險(xiǎn)率判斷胎兒是否患病,遺傳咨詢和產(chǎn)前基因診斷,產(chǎn)前基因診斷羊水細(xì)胞（16~20周）絨毛膜細(xì)胞（8~12周）非創(chuàng)傷性取樣母體外周血中胎兒游離DNA,遺傳咨詢戰(zhàn)略路線（以DMD為例）,MD是否由Dystrophin缺陷所致?,,是。孕婦是否攜帶者？,,,是?；蚩赡苁?。胎兒性別？,,,,男孩。分子生物學(xué)研究,不是。尋找引起本病的原因,不是。不進(jìn)行

25、產(chǎn)前基因診斷，但應(yīng)研究家系中其他有風(fēng)險(xiǎn)者,女孩。不進(jìn)行分子生物學(xué)研究,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,C50: C49: C45: C44: Cjp:,11223,C50: C49: C45: C44: Cjp:,12212,21313,C50: C49: C4

26、5: C44: Cjp:,21121,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21121,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21121,12212,C50: C49: C45: C44: Cjp:,,12212,C50: C49: C45:

27、 C44: Cjp:,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,11223,12212,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21313,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,1

28、8,19,20,21,22,23,,,,,,,DMD家系分析,,,,1,2,,,,,,,,,,,,,,,5.8 5.8 2.8 3.4 4.5 4.5 0.9 0.9 0.9 N N N 4.8 4.8

29、 4.8 5 5 5,5.8 5.8 2.8 5.8 4.5 3.4 4.5 4.5 0.9 0.9 0.9 0.9 N N N N 4.8

30、 4.8 4.8 4.8 5 5 5 5,1 2 3 4,,,,,,,血友?。良蚁捣治?間接診斷的不確定性,遺傳標(biāo)志所帶的信息性有限（多態(tài)性程度不高）新突變基因重組（若遺傳標(biāo)志離致病基因的遺傳距離

31、為5cM, 此時(shí)基因重組的可能性為5%）家系成員不完整,,單基因病遺傳缺陷的實(shí)驗(yàn)診斷,肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良 (LGMD2) 是一類常染 色體連鎖隱性遺傳病，已有LGMD2A~2H8 種類型。由于遺傳學(xué)和臨床表現(xiàn)具高度異質(zhì)性，臨床診斷和分類十分困難,家系資料,致病基因的定位,用已報(bào)道的 LGMD2A~2H 8個(gè)基因所在位點(diǎn)附近共14個(gè)STR標(biāo)記對(duì)家系成員DNA樣本進(jìn)行連鎖分析，尋找與該家系連鎖的致病基因,致病基因定位結(jié)果,D2S377位點(diǎn)的

32、Lod Score值為1.85D2S286位點(diǎn)的Lod score值為0.51其他各位點(diǎn)的值均為負(fù)數(shù) Lod score值1： 支持連鎖Lod score值>3： 強(qiáng)烈支持連鎖,致病基因編碼產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果,先證者LGMD2B的基因編碼蛋白dysferlin條帶密度與正常對(duì)照相比有明顯下降其余各蛋白條帶與正常對(duì)照相比無(wú)明顯改變,DYSF--LGMD2B的致病基因,DYSF基因全長(zhǎng)150kb，有55個(gè)外顯子cDNA長(zhǎng)

33、度為6.9kb，含有一個(gè)6243bp的開放讀碼框，編碼2080個(gè)氨基酸,DYSF基因突變的檢測(cè),在DYSF基因的突變熱點(diǎn)區(qū)篩查，以期發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致 dysferlin缺陷的基因突變逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物克隆至載體后作序列分析,G,,DYSF基因檢測(cè)結(jié)果,cDNA第6425/6426位(52號(hào)外顯子) 缺失 1個(gè)G堿基 (6425/6426 del G)第2019位密碼子agg agc，下游讀碼發(fā)生移位，使第2035位密碼子atg