小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)概要

1、小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng),,一、立題依據(jù),有利于進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性的研究 為下一步的傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件可以直接應(yīng)用于臨床實(shí)踐，是研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作用的前提,1、小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)的意義,2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法貼壁培養(yǎng)篩選法密度梯度離心法,3、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用前景在適當(dāng)?shù)臈l件下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為三個胚層來源的組織細(xì)胞而進(jìn)行細(xì)胞移植的治療，在體外培養(yǎng)擴(kuò)增后也可種

2、植于生物材料上，回植入機(jī)體修復(fù)組織損傷。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在治療組織器官退行性疾病、遺傳缺陷性疾病和基因治療方面也展現(xiàn)了美好前景。,二、材料和方法,成年小白鼠4只胎牛血清（杭州四季清公司）L-DMEM (Hyclone賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司） 胰蛋白酶（Sigma公司）PBS（NaCl 8g,KCl 0.2g,NaHPO4·12H2O 2.88g,KH2PO4 0.2g,三蒸水1000ml)Percoll

3、細(xì)胞分離液（Percoll原液：三蒸水:NaCl 2.6:1.9:0.5)青霉素、鏈霉素（100U/ml青霉素，100µg/ml鏈霉素）8%NaHCO3溶液（8gNaHCO3,100ml超純水）,1、材料,2、儀器,倒置顯微鏡尼康TE2000E（上海于欣儀器有限公司）CO2恒溫培養(yǎng)箱MC0-15A(日本三洋電機(jī)楳氏會公司) 超凈工作臺SW-CJ-2F（蘇州安泰空氣技術(shù)公司）生物顯微鏡（舜宇公司）低溫高速離心機(jī)（Jo

4、uan公司) 無菌操作臺，血球計(jì)數(shù)板，6孔培養(yǎng)板等,3、方法,骨髓的收集 Percoll密度梯度離心法分離純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 貼壁培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 形態(tài)學(xué)觀察 原代培養(yǎng)細(xì)胞生長曲線的測定,,,,,,（一）骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察,24 h后就見有細(xì)胞貼壁，多數(shù)細(xì)胞呈圓形 （圖1A）,72 h后首次半量換液去除未貼壁細(xì)胞，此時(shí)貼壁的細(xì)胞為單個，形態(tài)大部分為圓形 （圖1B),,三、結(jié)果,結(jié)果一,

5、第1次換液后5～7 d可見由幾十個到數(shù)百個細(xì)胞組成的集落，細(xì)胞形梭態(tài)呈形、三角形或星形 （圖1C、D）,結(jié)果一,原代細(xì)胞培養(yǎng)10 d左右，細(xì)胞快速增殖，每個集落中的細(xì)胞不斷增殖呈長梭形放射狀排列（圖1E）,培養(yǎng)2周左右，每個小集落形成約數(shù)百致上千個細(xì)胞的大集落，集落交界處出現(xiàn)重疊、融合 （圖1F),圖1.倒置顯微鏡下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)形態(tài)觀察Fig.1 Morphology of BMSCs in primary culture

6、 under an inverted microscope (A)1d,×100;(B)3d,×100;(C)5d,×200;(D)7d,×200;(E)9d,×400;(F)13d,×400.,結(jié)果二,（二）原代小鼠骨髓MSCs的生長曲線結(jié)果,BMSCs原代培養(yǎng)生長曲線（圖2），生長曲線表明BMSCs的增殖能力很強(qiáng)，所測細(xì)胞在開始的前4天里生長緩慢處于潛伏適應(yīng)期

7、，第5天開始迅速增長進(jìn)入對數(shù)生長期，到第9天細(xì)胞數(shù)輕度上升，第10天達(dá)到頂點(diǎn)，生長速度減緩進(jìn)入平臺期。,,,,四 討論,分離骨髓MSCs的方法主要有四種：貼壁篩選法、密度梯度離心法、免疫磁珠分離法、流式分選法等。我們使用密度梯度離心和貼壁篩選法相結(jié)合，能有效地將紅細(xì)胞、白細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞分離開來，同時(shí)操作簡便，快速，對細(xì)胞的活性影響較小。且此分離法簡單經(jīng)濟(jì)，因而被廣泛應(yīng)用。,,據(jù)本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)細(xì)胞的經(jīng)驗(yàn)，如果操作中吸取界面層細(xì)胞不小心，

8、會混進(jìn)非單核細(xì)胞，就會大大降低細(xì)胞分離的純度，使分離出的細(xì)胞大小不均。另外，細(xì)胞分離操作時(shí)間延長，操作不輕柔，分離出的細(xì)胞純度降低，都會降低細(xì)胞的貼壁率和存活率。,有時(shí)在相同的培養(yǎng)條件下，有極少數(shù)標(biāo)本較難擴(kuò)增骨髓MSCs，可能與沖洗骨髓腔的操作有關(guān)。骨髓MSCs具有黏附貼塑料瓶壁的特性，在實(shí)驗(yàn)中用玻璃瓶也能培養(yǎng)擴(kuò)增。在原代培養(yǎng)物中，除了呈成纖維細(xì)胞樣的MSCs外，還混雜著一些其他細(xì)胞，可以根據(jù)這些污染細(xì)胞生物學(xué)特性將其除去。血清的濃度并

9、非越高越好，相反，高濃度血清由于含有大量促進(jìn)細(xì)胞分化的因子，已引起細(xì)胞分化，從而使細(xì)胞過早出現(xiàn)老化，反而不利于干細(xì)胞生長，一般以5%～10%胎牛血清最適合MSCs的生長。細(xì)胞接種密度過密，會引起細(xì)胞之間的接觸抑制；而過稀又會導(dǎo)致細(xì)胞分泌的因子不足從而影響細(xì)胞的生長。一般適宜密度為（48）×104個/ml。,討論,五 結(jié)論,本實(shí)驗(yàn)通過對成年小白鼠骨髓MSCs進(jìn)行分離，體外培養(yǎng)，同時(shí)從細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)特性進(jìn)行觀察和檢測，認(rèn)為采用淋