抗生素敏感實驗

1、第三十四章抗微生物藥物和敏感性試驗陳文昭,,第一節(jié) 臨床常用抗菌藥物,抗菌藥物（antibacterial agents）:具有殺菌或抑菌活性的抗生素和化學合成藥物?？股兀杭毦?、真菌、放線菌等的代謝產(chǎn)物化學合成藥物：經(jīng)化學改造的半合成抗生素和化學合成藥物,,抗菌藥物： 對病原微生物具有較高的 “選擇性毒性作用” 對患者不造成損害,抗菌藥物的作用機制,a.干擾細菌細胞壁的合成

2、b.損傷細菌細胞膜c.影響細菌蛋白質(zhì)的合成d.抑制細菌核酸的合成e.抑制細菌葉酸的代謝f.抑制結核環(huán)脂酸的合成,一、青霉素類抗生素,天然青霉素：青霉素G 青霉素V 不產(chǎn)青霉素酶的G+球菌和G-球菌 耐青霉素酶青霉素：苯唑西林 氯唑西林 奈夫西林 氟氯西林 產(chǎn)青霉素酶的G+菌和G-球菌,氨基組青霉素：氨芐西林

3、 阿莫西林等 青霉素G敏感的細菌，大部分大腸、奇變、流感等G-菌。 羧基組青霉素：替卡西林 羧芐西林等 氨芐西林無效的G-菌，產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的腸桿菌和假單胞菌有作用脲基組青霉素：美洛西林 阿洛西林 派拉西林等 75％克雷伯菌、銅綠假單胞菌有抑制作用，腸桿菌、厭氧菌有好作用、對腸球菌和鏈球菌強于羧基組,廣譜青霉素：,作用機制,青霉素類抗生素作用于細胞壁合成后階

4、段的酶 阻斷肽聚糖合成的最后階段—肽聚糖鏈的組裝和三維結構的構建。 該階段由下面幾種酶催化完成： 轉糖基酶、轉肽酶、D-羧肽酶、內(nèi)肽酶 不同β-內(nèi)酰胺類抗生素在不同程度上有抑制上述酶的作用,二、頭孢菌素類抗生素,第一代頭孢菌素：頭孢噻吩、頭孢唑啉等 對G+菌有較強作用 第二代頭孢菌素：頭孢呋辛、頭孢克洛等

5、 對產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的G-桿菌有作用第三代頭孢菌素：頭孢噻肟、頭孢他啶等 對產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的G-桿菌有較強的作用第四代頭孢菌素：頭孢吡肟、頭孢匹羅等 對腸桿菌科細菌和銅綠假單孢菌作用強,作用機制,頭孢菌素類抗生素和青霉素結合蛋白結合,抑制細菌細胞壁合成。PBP位于質(zhì)膜，不同的頭孢菌素與不同的PBP結合，發(fā)生不同的效應，使菌形成絲狀體或球體，最終溶解死亡。,三、其他β-內(nèi)酰胺類抗生素,單環(huán)-內(nèi)酰胺

6、類抗生素：氨曲南 對G-桿菌作用強頭霉素類：頭孢西丁、頭孢替坦、頭孢美唑 對G+菌和產(chǎn)ESBLS有較好作用氧頭孢烯類：拉氧頭孢-氧頭孢烯類衍生物 對產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的G-桿菌有較強的作用，對產(chǎn)酶的金葡菌也有一定作用碳青霉烯類抗生素：亞胺培南、美洛培南等 對G-桿菌（除嗜麥芽窄食單胞菌外）有很強的活性,三、其他β-內(nèi)酰胺類抗生素,β-內(nèi)酰胺酶抑制

7、劑- 與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用能增強后者的抗菌活性克拉維酸 可從鏈霉菌培養(yǎng)液中分離得到舒巴坦 半合成的酶抑制劑他唑巴坦 半合成的酶抑制劑青霉素+ β -內(nèi)酰胺酶抑制劑,四、氨基糖苷類抗生素,鏈霉素 、卡那霉素 、妥布霉素 、核糖霉素 、巴龍霉素 、新霉素 慶大霉素 、福提霉素阿米卡星、奈替米星、 地貝卡星革蘭陰性桿菌有強大的抗菌活性 ；革蘭陰性球菌效果差；革蘭陽性球菌有一定活性大觀霉素、丙大觀

8、霉素：淋病奈瑟菌敏感，解脲脲原體敏感,作用機制,氨基糖苷類抗生素和細菌核糖體30S小亞基發(fā)生不可逆的結合，抑制MRNA的轉錄和蛋白合成；造成遺傳密碼子的錯讀，產(chǎn)生無意義的蛋白質(zhì)；吸附在菌體表面，造成細胞膜的損傷，導致膜的滲漏，胞內(nèi)的K+、腺嘌呤等物質(zhì)外漏。,喹諾酮類抗生素,第一代喹諾酮類抗生素：奈啶酸等 大腸桿菌有作用第二代喹諾酮類抗生素：環(huán)丙沙星、氧氟沙 星、諾氟沙星等 對G+菌和G-菌均有

9、作用第三代喹諾酮類抗生素（超廣譜類抗生素）：左氧氟沙星、司帕沙星等 對G+菌（如MRS、PRSP、腸球菌）作用強于二代4-8倍,作用機制,作用于DNA旋轉酶,干擾細菌DNA的修復和重組,六、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,常用的有：紅霉素、麥迪霉素等 主要用于G+菌，對苛養(yǎng)菌及厭養(yǎng)菌有作用，對衣原體、支原體、立克次體、螺旋體等有抑制作用新一代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素：阿齊霉素、羅紅霉素、克拉霉素、地紅霉素等

10、 較紅霉素有更強的抗菌活性,作用機制,大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可逆結合在細菌核糖體50S大亞基的23S單位上,抑制肽?；D移酶,影響核蛋白位移,抑制細菌蛋白合成和肽鏈的延伸。,七、四環(huán)素、氯霉素和林可酰胺類抗生素,四環(huán)素類抗生素 廣譜抗生素 米諾環(huán)素 多西環(huán)素等 四環(huán)素類抗生素主要與細菌30S核糖體亞單位結合，阻滯

11、氨?；D移RNA與信使RNA核蛋白體的受位位點的結合，阻滯肽鏈延伸，抑制蛋白質(zhì)合成。,七、四環(huán)素、氯霉素和林可酰胺類抗生素,氯霉素類抗生素 易進入腦組織 氯霉素 甲砜霉素 氯霉素主要作用于細菌70S核糖體的50S亞基，使肽鏈延長受阻而抑制蛋白質(zhì)合成。,七、四環(huán)素、氯霉素和林可酰胺類抗生素,林可酰胺類抗生素 鹽酸林可霉素

12、 克林霉素 G+球菌、白喉桿菌、 破傷風 梭菌、厭氧菌、沙眼衣原體 林可酰胺類抗生素與細菌50S核糖體亞基結合，抑制蛋白質(zhì)合成，并可干擾肽?；霓D移，阻止肽鏈的 延長。,八、糖肽類抗生素,萬古霉素 替考拉寧 對 G+球菌有強大的活性多粘菌素B和E G-菌強大的活性 糖肽類抗生素與一個或多個肽聚糖合成

13、中間產(chǎn)物D-丙氨酰-D-丙氨酸末端形成復合物，可阻斷肽聚糖合成中的轉糖基酶、轉肽基酶及D-D羧肽酶的作用。,磺胺類藥物及增效劑,用于全身感染，口服吸收好：磺胺甲惡唑、磺胺嘧啶、磺胺甲氧吡嗪；用于腸道，口服吸收差：柳氮磺胺啶銀、磺胺二甲氧嘧啶；局部應用：磺胺米隆、磺胺醋酰鈉,作用機制,磺胺類藥物分子結構中含有對氨基笨磺酰胺，能竟爭性地與二氫葉酸合成酶結合，阻止氨基苯甲酸與二氫葉酸合成酶結合，使菌體內(nèi)核酸合成重要物質(zhì)輔酶F（四氫葉酸）鈍

14、化而導致細菌生長受到抑制。 甲氧芐胺嘧啶（TMP）能與二氫葉酸還原酶結合，抑制二氫葉酸還原酶，使二氫葉酸還原成四氫葉酸受阻而達到抑菌目的。,其他合成抗菌藥,硝基呋喃類：用于腸道、尿路感染和外用 呋喃坦啶、呋喃唑酮 干擾細菌體內(nèi)的氧化還原酶系統(tǒng)，阻斷細菌的代謝，產(chǎn)生抑殺細菌的作用,其他合成抗菌藥,硝基咪唑類：甲硝唑、替硝唑

15、 用于厭氧菌 硝基咪唑類藥物被厭氧菌還原而阻斷DNA合成，從而阻止DNA的轉錄復制，導致細菌死亡。 替硝唑可干擾DNA合成，并能穿透細胞膜，快速進入細胞內(nèi)。,第二節(jié) 抗菌藥物敏感性試驗,抗菌藥物敏感性試驗的意義試驗常規(guī)抗菌藥物選擇抗菌藥物敏感性試驗的方法 肉湯稀釋法 瓊脂稀釋法 紙片瓊脂擴散法 E

16、試驗,抗菌藥物敏感性試驗的意義,預測療效指導醫(yī)生合理選擇抗生素耐藥監(jiān)測，分析耐藥變遷，掌握耐藥菌感染的流行情況，控制預防耐藥菌感染的發(fā)生和流行,試驗常規(guī)抗菌藥物選擇,根據(jù)NCCLS標準：A組：常規(guī)首選藥物B組：臨床使用主要抗生素C組：對A組藥物耐藥的流行菌株，對A組過敏的病人和不常見的細菌U組：僅用于尿道中分離的細菌,方法：肉湯稀釋法,常量稀釋法和微常量稀釋法培養(yǎng)基：M-H肉湯（苛養(yǎng)菌加添加劑）藥物稀釋

17、 藥物原液制備 稀釋抗菌藥物 菌種接種 （對數(shù)生長期，5X105 CFU/ML） 結果判斷,方法：瓊脂稀釋法,培養(yǎng)基：M-H瓊脂（苛養(yǎng)菌加添加劑）含藥瓊脂制備菌種接種（對數(shù)生長期 0.5麥氏單位）結果判斷,方法：紙片瓊脂擴散法,試驗原理：將含有抗菌藥物的紙片貼于已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中藥物吸收瓊脂中水分后向紙片周圍擴散

18、形成遞減的梯度濃度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)，測試菌的生長被抑制，形成無菌生長的透明圈即為抑菌圈。,紙片瓊脂擴散法,培養(yǎng)基：M-H瓊脂抗菌藥物紙片菌種接種結果判斷和報告,方法： E試驗,原理：結合稀釋法和擴散法原理對微生物藥 物敏感性試驗直接定量的技術E試條：無孔載體上固定有一系列預先制備的，濃度呈連續(xù)指數(shù)增長稀釋抗生素，另一面有讀數(shù)和判別的刻度。細菌接種和加樣結果判斷和報告,,

19、,,,,,,,,,,E,F,B,C,A,D,,,,,,,,MIC,,E test法,,,,,,MIC,ETST,藥物敏感性試驗結果解釋,敏感：測試菌可被測定藥物常規(guī)劑量給藥后，在機體內(nèi)達到的血藥濃度所抑制或殺滅。耐藥：測試菌不能被在體內(nèi)感染部位可能達到的抗菌藥物濃度所抑制。中介：提示該細菌對常規(guī)用藥后，體液或組織中的藥物濃度的反應低于敏感株，但在一些部位（如尿液中的喹諾酮類）或使用高于正常給藥量（如β-內(nèi)酰胺類）臨床上使用有療效。,

20、聯(lián)合藥物敏感試驗和殺菌試驗,聯(lián)合藥物敏感試驗的意義 治療混合感染 預防和推遲抗生素耐藥性的發(fā)生 可減少劑量以避免達到中毒劑量 比單一用藥時效果更好,聯(lián)合藥物敏感試驗和殺菌試驗,抗菌藥物聯(lián)合應用可出現(xiàn)4種結果：無關作用拮抗作用累加作用協(xié)同作用最低殺菌濃度測定,監(jiān)控抗生素的治療效果試驗,血清抗菌藥物濃度測定1、微生物測定法2、熒光偏振免疫測定3、高壓液相層析法4、均相酶免疫測定法血清抗菌

21、活性測定,自動化儀器檢測,自動化儀器Microscan 、Vitek都有測定MIC功能和檢測ESBL的專用孔和專家系統(tǒng)。,第三節(jié)細菌的耐藥性和產(chǎn)生機制,專題講座,第四節(jié)細菌的耐藥性檢查方法,,特殊耐藥菌檢測,對MRSA/MRSE檢測青霉素耐藥的肺炎鏈球菌（PRSP）檢測對萬古霉素耐藥的腸球菌(VRE)檢測ESBLS檢測 Ampc檢測,一、MRSA/MRSE檢測,1、正確鑒定葡萄球菌2、MRSA/MRSE的鑒定

22、 高滲培養(yǎng)基（2~4%Nacl） 較低的孵育溫度（33~35攝氏度） 時間：MRSA 24h MRSE 48h,檢測MRSA/MRSE的方法,甲氧西林或苯唑西林篩選RSA/MRSE標準紙片擴散法微量肉湯稀釋法,甲氧西林或苯唑西林篩選MRSA/MRSE,MH瓊脂+4% Nacl+苯唑西林 6μg或甲氧西林10μg用0.5McFarland菌液接種35℃

23、 孵育24h肉眼可見的菌落生長即為MRS,標準紙片擴散法,在M.H瓊脂(2% Nacl)上用0.5McFarland的 菌液劃線接種。貼上甲氧西林或苯唑西林紙片（1μg），35℃孵育24h。苯唑西林抑菌圈小于或等于10mm。 甲氧西林抑菌圈小于或等于9 mm。,微量肉湯稀釋法,M.H肉湯+2%Nacl+苯唑西林或甲氧西林。用0.5Mcfarland菌液接種，35℃孵育24hMIC：苯唑西林≥4μg/ml

24、 甲氧西林≥16μg/ ml,二、對青霉素耐藥的肺炎鏈球菌（PRP）的檢測,篩選：苯唑西林紙片預測肺炎鏈球菌對青霉素的敏感性方法:用含1μg苯唑西林紙片,標準K—B法作藥敏試驗,,結果：抑菌環(huán)≥20 mm敏感 MIC ≤19 mm作肉湯或瓊脂稀釋試驗測MIC 藥物的選擇：青霉素、四環(huán)素、紅霉素、TMP/SMZ、頭孢菌素和萬古霉素。,,肺炎鏈球菌對青霉素的敏感株(MIC:0.03-0.06μg/ml)對氨芐西林

25、﹑阿莫西林﹑阿莫西林/克拉維酸﹑第二﹑三代頭孢菌素和泰能敏感.,,肺炎鏈球菌對青霉素的MIC值≥1.0μg/ml的肺炎鏈球菌稱為耐青霉素的肺炎鏈球菌(PRP)MIC值在0.12-1.0μg/ ml之間的菌株為相對耐藥(低耐)菌株(PIP)MIC≤0.6μg/ ml為敏感株,三、對萬古霉素耐藥的腸球菌,耐藥性可分為低水平耐藥(MIC8-32mg/L)高水平耐藥(MIC≥64mg/L)根據(jù)腸球菌對萬古霉素和替考拉寧的不同耐藥水平及耐

26、藥基因，VRE分為四個表型，分別是VanA﹑ VanB ﹑VanC ﹑VanD,VRE:的分型及其耐藥表型,類型 萬古霉素（μg/ ml） 替考拉寧VanA R（64-1000） R（16-512）VanB R（4-1024） S（0.25-2）VanC I （2-32） S (0.12-2)VanD （16-64） S（2-4）,,V

27、RE的檢測方法： 稀釋法，紙片擴散法 Etest 和自動化儀器VanA﹑B﹑C（Etest和瓊脂篩選法最好，敏感率為100%）,稀釋法VRE篩選試驗 （瓊脂稀釋法）,1、BHI瓊脂+6ug/ ml萬古霉素2、用0.5 Mcfarland菌液接種，35 ℃ 24h 3、 >1個菌落 R 肉湯：生長 R,,VRE篩選陽性必須做

28、MIC確認，并觀察動力和色素，以區(qū)分獲得性耐藥（VanA 、VanB）,及某些菌種存在的固有的中介（8-16μg/ ml）耐藥（VanC）,兩者在感染控制中意義不同。,四、ESBLS檢測,（一）初篩試驗 1.儀器 MIC≥2μg/ ml2.紙片擴散法 頭孢泊肟或頭孢他啶≤22 mm 頭孢曲松≤25 mm

29、 頭孢噻肟或氨曲南≤27mm,四、ESBLS檢測,（二）確證實驗 頭孢他啶（CAZ） 頭孢他啶+克拉維酸（CAZ/CLV） 頭孢噻肟（CTX） 頭孢噻肟+克拉維酸（CTX/CLV） 差值≥5mm 確定為ESBLs,五、Ampc 檢測,三維實驗 制粗提酶： 將50ul0.5麥氏單位待測菌液加入12ml肉湯中 35℃搖床上震搖4-6h，離心

30、4000轉/min 集菌 -80℃反復凍溶5次， 4℃ 10000轉/min 離心收集上清液-20℃保存。,,2.檢測AMP C酶 在MH平板上均勻涂抹0.5麥氏單 位ATCC25922 中心貼頭孢西叮紙片 在距紙片5mm處切槽 將粗提酶液加入槽內(nèi) 35℃孵育24h 如果在抑菌圈內(nèi)有細菌生長，則AMP C 陽性。,,第五節(jié) 抗分枝桿菌藥物敏感性試驗,抗分枝桿菌藥物一線藥：

31、 異煙肼、 利福平、 吡嗪酰胺、 乙胺丁醇、 鏈霉素二線藥： 氨基水楊酸、 乙硫異煙胺、 環(huán)絲氨酸、 卷曲霉素、 卡那霉素 、 利福噴丁,結核分枝桿菌和緩慢生長分枝桿菌體外抑菌試驗,結核分枝桿菌體外藥敏試驗指針結核分枝桿菌體外藥敏試驗方法 培養(yǎng)基 Middlebrook7H10瓊脂+油酸、白蛋白、葡聚糖等 藥敏試驗藥物 細菌接種,快速生長分枝桿菌體外藥敏試驗,1、稀釋法：

32、 操作方法基本同需氧和兼性厭氧法MH肉湯或CAMHB加入0.02％Tween 80和玻珠，接種菌液，30℃孵育3-5天。,快速生長分枝桿菌體外藥敏試驗,2、瓊脂紙片洗脫法 先將含藥紙片放入6孔組織培養(yǎng)板中，以洗脫液洗脫，再加入溶化冷卻的HA4.5ML，使之凝固成含藥平板。 0.5麥氏單位菌液-1：100稀釋 每孔10微升 30℃孵育