生殖發(fā)育毒性作用

1、生殖發(fā)育毒性,畸胎學(xué)（古代）現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)畸胎學(xué)（十九世紀(jì)）發(fā)育毒理學(xué)（二十世紀(jì)）,,,第一節(jié) 概 述,Teratology (畸胎學(xué)) 來(lái)自于希臘語(yǔ)monster (怪胎) ，即 teras (畸胎) 。1651年，William Harvey提出發(fā)育障礙學(xué)說(shuō)：畸形起因于器官或結(jié)構(gòu)的不完全發(fā)育。,物理化學(xué)因素,,雞蛋,畸形小雞：神經(jīng)管缺陷、無(wú)腦畸形、脊柱裂、獨(dú)眼畸形、心臟缺陷等,作用時(shí)間在決定畸形類型方面比損傷性質(zhì)更重要。,

2、致畸作用因素,電離輻射化學(xué)物和藥物病毒細(xì)菌感染吸煙酗酒母體代謝失調(diào),反應(yīng)停(thalidomide)事件孕婦的理想選擇？ 1953年，聯(lián)邦德國(guó)一家名為Chemie　Gruenenthal的制藥公司研究人員發(fā)現(xiàn)， 反應(yīng)停（沙立度胺）具有一定的鎮(zhèn)靜安眠作用，而且 對(duì)孕婦懷孕早期的妊娠嘔吐療效極佳。 1957年10月1日該公司將反應(yīng)停正式推 向市場(chǎng)。,當(dāng)時(shí)反應(yīng)停成了“孕婦 的理想選擇” ，在歐 洲、亞洲、非洲和南美洲被醫(yī)生大

3、量處方給孕婦以治療 妊娠嘔吐。,科學(xué)家們?cè)谘兄品磻?yīng)停時(shí)，并沒(méi)有料到這種藥物會(huì)產(chǎn)生如此可怕的副作用。,令人恐怖的副作用 到了1960年，歐洲的醫(yī)生 們開始發(fā)現(xiàn)，本地區(qū)畸形嬰兒的出生率明顯上升。這些嬰兒有的是四肢畸 形(主要是雙上肢的短肢畸形)，有的是腭裂，有 的是盲兒或聾兒，還有 的是內(nèi)臟畸形。,? 調(diào)查顯示，在第 34～ 50天是反應(yīng)停作用的敏感期。 ? 在此時(shí)間段以外服用反應(yīng)停，一般不會(huì)導(dǎo)致胎兒的出生缺陷。支付巨額賠償金

4、 ? 1970年4月10日，案件的控辯雙方于法庭外達(dá)成了和解，Chemie　Gruenenthal公司同意向控方支付總額1.1億德國(guó)馬克的賠償金。,一、生殖發(fā)育毒性作用的特點(diǎn)和影響因素,（一）發(fā)育各階段發(fā)育毒性作用的特點(diǎn) 1、著床前期 2、器官形成期 3、胎兒期 4、圍生期和出生后的發(fā)育期,1、著床前期,事件：發(fā)生受精、卵裂、進(jìn)入子宮腔、囊胚形成、原腸胚形成及著床。

5、時(shí)間：人類為受精后的第11－12天；嚙齒類動(dòng)物為最初的６天。特點(diǎn)：此期受損的是早期胚胎的相對(duì)未分化細(xì)胞，可通過(guò)代償性的細(xì)胞增生加以修補(bǔ)，不會(huì)產(chǎn)生局部缺陷，最多出現(xiàn)發(fā)育遲緩，若受損的細(xì)胞較多，可造成胚胎死亡，稱為著床前丟失。也有例外，如小鼠妊娠第2.5天、3.5天和4.5天用甲基亞硝脲處理可造成子代神經(jīng)管缺陷和腭裂。這一發(fā)育階段被稱為早期不易感期。,2、器官形成期,事件：細(xì)胞增殖、移動(dòng)和組合形成器官原基，即細(xì)胞結(jié)構(gòu)開始分化，并逐漸形成

6、不同的器官和組織。時(shí)間：人類為第3－8周；嚙齒類動(dòng)物為第1－3周。特點(diǎn)：此期細(xì)胞增殖分裂速度很快，組織器官生長(zhǎng)旺盛，胚胎對(duì)致畸物特別敏感，細(xì)胞受損可導(dǎo)致結(jié)構(gòu)畸形、生長(zhǎng)遲緩或胚胎死亡。這一發(fā)育階段被稱為致畸敏感期或致畸作用危險(xiǎn)期（critical period）。,不同器官敏感期不同，且有交叉重疊。表現(xiàn)為：不同器官致畸高峰時(shí)間不同，此期內(nèi)不同時(shí)間給予致畸物會(huì)誘發(fā)不同器官畸形，同一天染毒可引起多個(gè)器官受損。,人類胚胎的致畸敏感期,同一

7、致畸物，給予時(shí)間不同，會(huì)產(chǎn)生不同的畸形。即同一劑量同種致畸物在敏感期中與胚胎接觸，可因胚胎所處發(fā)育階段不同而出現(xiàn)不同的畸形。小鼠孕第8-12天的不同時(shí)間給予環(huán)磷酰胺，雖然均可引起足趾畸形，但是隨著給藥時(shí)間不同，分別出現(xiàn)多趾、并趾、缺趾、無(wú)趾。大鼠靜脈注射硝酸鉛，第9.5天引起后部畸形，第10天可引起大鼠死亡。,事件：主要是組織分化、生長(zhǎng)和生理學(xué)成熟。時(shí)間：人類是從第56-58天起，直到分娩。特點(diǎn)：胚胎的器官、系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)形成后

8、，致畸物難以使之發(fā)生結(jié)構(gòu)缺陷，通常是變形或異常而非畸形。胎兒期接觸外源性理化物質(zhì)，很可能對(duì)生長(zhǎng)和功能成熟產(chǎn)生效應(yīng)，主要表現(xiàn)為：全身生長(zhǎng)遲緩、特異的功能障礙、經(jīng)胎盤致癌和偶見死胎。,3、胎兒期,此期接觸外源性化學(xué)物質(zhì)，主要表現(xiàn)在發(fā)育免疫毒性、神經(jīng)行為發(fā)育異常和兒童期腫瘤。圍生期接觸外源化學(xué)物，會(huì)嚴(yán)重影響胎兒T細(xì)胞、B細(xì)胞和吞噬細(xì)胞的發(fā)育、遷移、歸巢及功能，可能暫時(shí)甚至永久性地?fù)p傷機(jī)體的免疫系統(tǒng)。許多化學(xué)物質(zhì)具有發(fā)育神經(jīng)毒性，表現(xiàn)為對(duì)

9、感覺、運(yùn)動(dòng)、自主和認(rèn)知等方面的影響。圍生期是一生中對(duì)致癌物最敏感的時(shí)期。,4、圍生期和出生后的發(fā)育期,（二）生殖發(fā)育毒性的物種差異,發(fā)育階段致畸效應(yīng)的特異性：胚胎所處的發(fā)育階段不同，對(duì)于致畸作用呈現(xiàn)不同的敏感性。有性生殖動(dòng)物的著床前胚泡對(duì)致死作用較為易感，對(duì)致畸作用較差。在胚胎發(fā)育后期和新生兒期的發(fā)育毒性表現(xiàn)為:生長(zhǎng)遲緩、神經(jīng)、內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)機(jī)能的改變。胎兒對(duì)致死作用的易感性較胚胎為低。,致畸的物種個(gè)體差異：任何環(huán)境有害因素的損

10、害效應(yīng)都存在物種品系及個(gè)體差異，在致畸作用中較突出。例如，殺蟲劑西維因?qū)﹄嗍缶哂兄禄饔茫瑢?duì)家免和倉(cāng)鼠并不致畸。農(nóng)藥敵枯雙對(duì)大鼠致畸作用明顯，但未得到人群調(diào)查的證實(shí)資料。同一物種不同品系對(duì)一種致畸物敏感性的差別很大，反應(yīng)停和脫氫皮質(zhì)酮都有這種現(xiàn)象。,可能由于同一致畸物在不同物種和同一物種的不同品系動(dòng)物的代謝過(guò)程有一定差異；也可能由于致畸物主要是通過(guò)母體胎盤作用于胚胎，而不同物種動(dòng)物胎盤構(gòu)造也不相同。這些差異可能是由于遺傳因素，即基因型差

11、異。,為什么會(huì)出現(xiàn)物種及種間差異？,（三）生殖發(fā)育毒性的劑量反應(yīng)關(guān)系模式：,A. 正常胎、生長(zhǎng)遲緩和結(jié)構(gòu)畸形同時(shí)存在，但較高劑量下幾乎引起全窩胚胎死亡。這種類型較常見，此類化學(xué)物低劑量下主要導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩，隨劑量的增加，導(dǎo)致畸形和死胎。多為細(xì)胞毒性致畸物，包括烷化劑、抗癌藥及很多致突變物。,B. 在遠(yuǎn)低于胚胎致死劑量下即可出現(xiàn)致畸，甚至全窩致畸，致畸胎兒常同時(shí)出現(xiàn)生長(zhǎng)遲緩。當(dāng)劑量增加到遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)全窩畸形時(shí)才出現(xiàn)胚胎死亡，后者的劑量范圍常常與

12、明顯的母體毒性劑量范圍重疊。這種模式表示受試物有高度致畸作用，較少見，如沙立度胺、糖皮質(zhì)類固醇等。,生殖發(fā)育毒性的劑量反應(yīng)關(guān)系模式：,C. 只有生長(zhǎng)遲緩和胚胎致死但沒(méi)有畸形發(fā)生。往往生長(zhǎng)遲緩先出現(xiàn)，曲線較平緩，較大劑量時(shí)才出現(xiàn)胚胎死亡，其曲線較陡，接近于“全或無(wú)”。表明胚胎存活有明顯的界限。這類化學(xué)物，可被認(rèn)為是有胚胎毒性（包括胚胎致死性）的，但不具有致畸作用。,生殖發(fā)育毒性的劑量反應(yīng)關(guān)系模式：,二、母體毒性與生殖發(fā)育毒性,（一）母體因

13、素對(duì)生殖發(fā)育毒性的影響： 母體毒性：化學(xué)毒物對(duì)受孕母體產(chǎn)生的損傷作用。表現(xiàn)為增重減慢、功能異常、臨床癥狀、甚至死亡。,母體因素對(duì)生殖發(fā)育毒性的影響,1、遺傳學(xué)：母體的遺傳結(jié)構(gòu)是胚胎發(fā)育的一個(gè)決定因素。如唇腭裂的發(fā)病率白種人明顯高于黑種人，主要原因在于母體，而非胚胎本身的基因結(jié)構(gòu)。 2、疾?。耗阁w受病毒感染、未控制的糖尿病等疾病，將會(huì)對(duì)胚胎產(chǎn)生影響。如懷孕前三個(gè)月，母體高熱、病毒感染等均可能導(dǎo)致胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形。,3、營(yíng)養(yǎng)：母

14、體蛋白質(zhì)、熱量、維生素、微量元素及酶的輔助因子缺乏將對(duì)胚胎產(chǎn)生影響。 4、應(yīng)激：不同形式的母體毒性可能通過(guò)誘導(dǎo)生理學(xué)應(yīng)激反應(yīng)而產(chǎn)生發(fā)育毒性。 5、對(duì)胎盤的毒性：胎盤是母體和胚胎進(jìn)行物質(zhì)交換的結(jié)構(gòu)，為胚胎提供營(yíng)養(yǎng)、氣體交換、廢物排出。胎盤可產(chǎn)生維持妊娠關(guān)鍵的激素，而且能代謝和儲(chǔ)存外源化學(xué)物。外源化學(xué)物既可透過(guò)胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，同時(shí)胎盤也可能是其作用靶點(diǎn)，或作為其儲(chǔ)存庫(kù)。,（二）母體毒性與胚胎毒性的關(guān)系,1、具有胚胎毒性，但無(wú)母體毒性

15、2、既有胚胎毒性，也有母體毒性3、具有母體毒性，但不具有胚胎毒性4、既無(wú)母體毒性，也無(wú)胚胎毒性 （一定劑量范圍內(nèi)）,三、父源性生殖發(fā)育毒性,父源性出生缺陷（paternal birth defect）影響因素：遺傳缺陷、年齡因素和外界暴露因素。父源性暴露引起子代發(fā)育異常包括：流產(chǎn)、死胎、低出生體重、畸形、功能障礙等。,第二節(jié) 生殖發(fā)育毒性作用機(jī)制,1、不發(fā)育(agenesis) 由于某些重要的原基組織(primordial

16、tissue)不存在或缺乏鄰近組織或前體組織的正常誘導(dǎo)而使原基組織不發(fā)生，結(jié)果某個(gè)器官或軀體部分發(fā)生或完全缺如。 2、發(fā)育不全(hypoplasia) 這種畸形常在名詞前冠以“小”字，如小頭、小眼等。此外，亦有軟骨發(fā)育不全等。 3、發(fā)育受阻 某器官或結(jié)構(gòu)發(fā)育至半途時(shí)受阻而停止，可分為四類：①不合并(non-fusion）；②不分裂(non-division），如動(dòng)脈干永存；③抑制遷移(sup-pressed migration）；④

17、暫時(shí)性結(jié)構(gòu)的保存(persistence of transitory structure），如肛門閉鎖、憩室等。,先天畸形的發(fā)生方式,4、相鄰原基粘連 如馬蹄腎，或原基分裂如分裂輸尿管。 5、生長(zhǎng)過(guò)度（overgrowth） 如多指、巨指或先天性角化過(guò)度等。 6、錯(cuò)位（misplacement） 如內(nèi)臟錯(cuò)位等。 7、錯(cuò)誤遷移（incorrect migration） 如卵巢遷移到外生殖器，并耳等。 8、不典型分化(atypica

18、l differentiation） 包括先天性腫瘤的形成、異位和分化。 9、返祖（atavism） 常見的有多毛、復(fù)乳等。,引發(fā)機(jī)制,1、基因突變與染色體畸變2、干擾基因表達(dá) 3、細(xì)胞損傷與死亡 4、細(xì)胞凋亡 5、干擾細(xì)胞間的交互作用 6、通過(guò)胎盤毒性引起發(fā)育毒性 7、干擾母體穩(wěn)態(tài) 8、內(nèi)分泌干擾作用,第三節(jié) 生殖毒性試驗(yàn)與評(píng)價(jià),外源化學(xué)物生殖毒性的評(píng)價(jià)需要四方面的資料： ①環(huán)境流行病學(xué)資料 ②控制下的臨床

19、研究資料 ③動(dòng)物生殖毒性試驗(yàn)資料 ④體外試驗(yàn)資料 作為一個(gè)新產(chǎn)品的登記與審批，主要根據(jù)前三類資料。在前三類資料中，首先是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)資料，因?yàn)榇蠖鄶?shù)情況下新產(chǎn)品在上市前，還沒(méi)有流行病學(xué)資料和控制下的臨床資料。,一、動(dòng)物生殖毒性試驗(yàn),優(yōu)點(diǎn)：容易控制接觸條件，控制接觸動(dòng)物的數(shù)量、年齡、狀態(tài)以及選擇檢測(cè)效應(yīng)指標(biāo)（終點(diǎn)）。 缺點(diǎn)：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推到人具有不確定性。,1、動(dòng)物選擇,試驗(yàn)中動(dòng)物應(yīng)選擇：食性和對(duì)受試物代謝過(guò)程與人

20、類接近，易飼養(yǎng)、易繁殖和價(jià)廉之外，還應(yīng)特別注意妊娠過(guò)程較短、每窩產(chǎn)仔數(shù)較多以及胎盤構(gòu)造與人類接近的動(dòng)物。試驗(yàn)可選用二種哺乳動(dòng)物，一般首先考慮大鼠，此外為小鼠或家兔。,大鼠受孕率高，易于得到足夠標(biāo)本數(shù)，且大鼠對(duì)大多數(shù)外源化學(xué)物代謝過(guò)程、基本與人類近似。但不足之處是大鼠對(duì)一般外源化學(xué)物代謝速度很高，對(duì)致畸物耐受性強(qiáng)、易感性低，有時(shí)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。小鼠自然畸形發(fā)生率較大鼠高。對(duì)形成腭裂的致畸物更較為敏感。家兔為草食動(dòng)物，與人類代謝功能差

21、異較大，妊娠期不夠恒定，自然發(fā)生率也較高。雞胚也可進(jìn)行致畸試驗(yàn)，可同時(shí)得到大量雞胚，胚胎發(fā)育條件也較易控制。但雞胚不是哺乳動(dòng)物，缺乏受試物與母體的相互作用。,2、劑量分組,致畸試驗(yàn)一般應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，找出引起母體中毒的劑量。一般用孕鼠8～10只，在妊娠5～16天內(nèi)給予受試物。如出現(xiàn)較嚴(yán)重的母體中毒、流產(chǎn)或胚胎大量死亡，將劑量略為降低，直到找出引起母體輕度中毒一般癥狀的劑量。根據(jù)預(yù)試結(jié)果進(jìn)一步確定正式試驗(yàn)劑量。,正式試驗(yàn)最少應(yīng)設(shè)3個(gè)劑量

22、組，另設(shè)對(duì)照組。 高劑量組——該劑量一般不超過(guò)LD50的1/5-1/3，應(yīng)引起母體輕度中毒，即進(jìn)食量減少、體重減輕、死亡不超過(guò)10%； 低劑量組——可以為L(zhǎng)D50的1/100-l/30，不應(yīng)觀察到任何中毒癥狀； 中劑量組——可以允許母體出現(xiàn)某些極輕微中毒癥狀，其劑量與高劑量和低劑量成等比級(jí)數(shù)關(guān)系。,如果已掌握或能估計(jì)人體實(shí)際接觸量，也可將實(shí)際接觸量作為低劑量，并以其10倍左右為最高劑量。急性毒性較強(qiáng)的受試物，所

23、采用劑量應(yīng)稍低，反之可較高。,接觸受試物的方式與途徑應(yīng)與人體實(shí)際接觸情況一致。大鼠和小鼠一般可自受孕后第5天開始接觸受試物，每日一次，持續(xù)到第15天。如研究器官易感性，則應(yīng)在上述期間增加動(dòng)物組數(shù)，將受試物每日分別給予不同組的動(dòng)物，根據(jù)畸形出現(xiàn)的情況，確定受試物的敏感時(shí)間和靶器官。,試驗(yàn)期間每天稱取母鼠體重。根據(jù)體重增長(zhǎng)，隨時(shí)調(diào)整劑量，觀察受孕動(dòng)物的妊娠情況和胚胎發(fā)育情況。受孕動(dòng)物的體重持續(xù)增長(zhǎng)，表示妊娠過(guò)程及胚胎發(fā)育正常。,3、 實(shí)驗(yàn)終

24、點(diǎn)檢查,自然分娩前1～2日將受孕動(dòng)物處死剖腹，取出子宮及活產(chǎn)胎仔，記錄死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后第19～20天，小鼠第18～19天，家免在第29天。胎仔在臨近出生期間，發(fā)育進(jìn)展極為迅速。相差半日，發(fā)育情況即有顯著差異，骨骼發(fā)育尤為顯著。,孕鼠處死后，從子宮頂端依次取出其中活產(chǎn)幼仔、死胎以及吸收胎，并記錄編號(hào)。大鼠和家免還應(yīng)取出卵巢，記錄黃體數(shù)用來(lái)代表排卵數(shù)。活產(chǎn)胎仔取出后，先檢查性別，逐只稱重，并按窩計(jì)算平均體重，然后進(jìn)行畸形檢

25、查。為保證哺乳機(jī)會(huì)，一般主張每窩保留8只幼仔，并盡量雌雄數(shù)量相等。,動(dòng)物試驗(yàn)的缺點(diǎn)：,1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推到人的不肯定性：由于致畸作用存在種屬差異和品系差異，故對(duì)一種受試物須多次重復(fù)同一實(shí)驗(yàn)，均出現(xiàn)一定畸胎發(fā)生率，才能認(rèn)為畸胎發(fā)生與該受試物有關(guān)。至少應(yīng)能在兩種以上實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)中都顯示肯定能夠的致畸作用才能可靠的推導(dǎo)于人。但只要受試物在一種動(dòng)物具有致畸作用，就應(yīng)警惕它對(duì)人類具有的潛在危險(xiǎn)性。,2、動(dòng)物高劑量接觸與人類實(shí)際低劑量接

26、觸的區(qū)別 阿司匹林和磺胺類藥物對(duì)大鼠有致畸作用，但這些藥物人類已長(zhǎng)期使用，并未發(fā)現(xiàn)肯定的致畸作用，可能是人所利用的劑量未達(dá)到可引發(fā)致畸的程度。維生素A常用作致畸的陽(yáng)性對(duì)照物，給大鼠1000mg/kg劑量可引發(fā)畸胎，按此劑量推算，50kg體重的人每天應(yīng)服用50ml的魚肝油，才會(huì)產(chǎn)生致畸作用，而人類很難攝取如此大量的魚肝油，故到目前為止，維生素A并未被列為人類的致畸物。一定要考慮人類的實(shí)際接觸劑量。此外更要重視流行病學(xué)的調(diào)查，設(shè)法收集

27、接觸者的流行病學(xué)及臨床資料，只有將動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與流行病學(xué)調(diào)查資料結(jié)合起來(lái)，進(jìn)行綜合分析，才能得出正確的結(jié)論。,對(duì)大多數(shù)化學(xué)物質(zhì)來(lái)說(shuō)，三段生殖毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)通常是最適當(dāng)?shù)模P(guān)鍵因素是各個(gè)生殖階段之間不得有間隔，即在三個(gè)有關(guān)聯(lián)的階段接觸受試物的時(shí)期至少有一天的重疊，并能直接或間接地評(píng)價(jià)生殖過(guò)程的所有階段。,生殖發(fā)育過(guò)程可分為6個(gè)階段,A. 從交配前到受孕：檢查成年雄性和雌性生殖功能、配子的發(fā)育與成熟、交配行為、受精。B.從受孕到著床：檢查成

28、年雌性生殖功能、胚胎著床前發(fā)育、著床。C.從著床到硬腭閉合：檢查成年雌性生殖功能、胚體發(fā)育、主要器官形成。,D.從硬腭閉合到妊娠結(jié)束：檢查成年雌性生殖功能、胚體的發(fā)育與生長(zhǎng)、器官的發(fā)育與生長(zhǎng)。E.從出生到斷乳：檢查成年雌性生殖功能、新生仔對(duì)宮外生活的適應(yīng)性、斷乳前的發(fā)育與生長(zhǎng)。F.從斷乳到性成熟：檢查斷乳后的發(fā)育與生長(zhǎng)，對(duì)獨(dú)立生活的適應(yīng)、達(dá)到完全的性功能。,三段生殖毒性試驗(yàn),生育力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)（一般生殖毒性試驗(yàn)）胚體-

29、胎體毒性試驗(yàn)(致畸試驗(yàn))出生前后發(fā)育毒性試驗(yàn)(圍生期毒性試驗(yàn)),,三段生殖試驗(yàn)圖解 Ⅰ. 生育力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)（一般生殖毒性試驗(yàn)） Ⅱ. 胚體-胎體毒性試驗(yàn)（致畸試驗(yàn)） Ⅲ. 出生前后發(fā)育毒性試驗(yàn)（圍產(chǎn)期毒性試驗(yàn)）,1、生育力和早期胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)

30、 （一般生殖毒性試驗(yàn)）,研究目的：評(píng)價(jià)化學(xué)毒物對(duì)配子發(fā)生和成熟、交配行為、生育力、胚體著床前和著床的影響。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：至少一種，首選大鼠。每組雌雄各16～20只（窩）。給藥時(shí)間：交配前雄性4周，雌性2周，交配期（2～3周），雌性著床前（大鼠孕6天）。終末處理：雄性證實(shí)交配并使雌性受孕成功后處死，雌性在受孕13～15天終止妊娠。,觀察指標(biāo)雄性：飲水量、攝食量、體重變化、睪丸、附睪重量及臟器系數(shù)、附睪精子計(jì)數(shù)、活動(dòng)度和形態(tài)觀

31、察、生育率、睪丸附睪病理組織學(xué)檢查；雌性：飲水量、攝食量、體重變化、一般健康狀況及死亡數(shù)、交配行為、受孕率、卵巢和子宮組織學(xué)檢查；孕鼠：妊娠體重變化，處死后檢查黃體數(shù)、著床數(shù)、吸收胎、死胎和活胎數(shù)。結(jié)果評(píng)定：F0代和F1代毒性及NOAEL，考慮各組受影響的窩數(shù)等。,,2、胚體-胎體毒性試驗(yàn) （致畸試驗(yàn)）,研究目的：評(píng)價(jià)母體自胚泡著床到硬腭閉合期間接觸受試物對(duì)妊娠雌性和對(duì)胚體-胎體發(fā)育的有害影響。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：通常兩種，嚙齒類首

32、選大鼠，非嚙齒類可選家兔，每組雌雄各16～20只（窩）。給藥時(shí)間：大鼠、小鼠孕6～15天，家兔孕6～18天。終末處理：妊娠結(jié)束前一天處死，胎仔一半茜素紅染色，觀察骨骼，另一半Bouin’s液固定，觀察內(nèi)臟。,觀察指標(biāo)母體：體重變化、中毒癥狀、黃體數(shù)、著床數(shù)、吸收胎、早死胎、晚死胎和活胎數(shù)、胎盤重量；胎仔：性別、體重、身長(zhǎng)、外觀畸形、內(nèi)臟畸形、骨骼畸形和發(fā)育情況。結(jié)果評(píng)定：母體毒性及NOAEL，胚胎毒性、致畸性及NOAEL。,,

33、3、出生前和出生后發(fā)育毒性試驗(yàn) （圍生期毒性試驗(yàn)）,研究目的：研究母體自著床至斷乳期間接觸化學(xué)毒物對(duì)妊娠／哺乳母體、孕體及子代發(fā)育直至成熟的有害影響。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：至少一種，首選大鼠，每組雌雄各16～20只（窩）。給藥時(shí)間：雌性從著床到哺乳期結(jié)束，大鼠孕15天至產(chǎn)后28天。終末處理：斷乳后處死母體和部分幼仔，每窩選8只撫育到性成熟并交配，評(píng)價(jià)生育力的F1代在F2代出生后處死。,觀察指標(biāo)母體：飲水量、攝食量、體重變化、中毒狀況

34、及死亡率、妊娠分娩時(shí)間、產(chǎn)仔數(shù)、受孕率；F1代：性別比例、外觀畸形、出生存活率、哺育存活率、生長(zhǎng)指數(shù)，生理發(fā)育和斷乳前神經(jīng)行為檢測(cè)；哺乳后處死檢查主要臟器及睪丸附睪或卵巢子宮重量、內(nèi)臟畸形；斷乳后行為測(cè)試，交配行為及受孕率。結(jié)果評(píng)定：母體毒性及NOAEL，胚胎毒性、致畸性、子代神經(jīng)行為影響及NOAEL。,,觀察指標(biāo)：受孕率（％）:反映雄性動(dòng)物生育能力以及雌性動(dòng)物受孕情況 正常分娩率（％）:反映雌性動(dòng)物妊娠過(guò)程是否受到影響 幼

35、仔出生存活率（％）:反映雌性動(dòng)物分娩過(guò)程是否正常 幼仔哺育成活率（％）:反映雌性動(dòng)物授乳哺育幼仔的能力 性別比生育指數(shù)：受孕雌鼠/同籠雌鼠除上述指標(biāo)外，還應(yīng)該注意出生幼仔是否有畸形存在，對(duì)死亡的幼仔應(yīng)進(jìn)行畸形檢查，可為下一步致畸試驗(yàn)提供參考,生殖毒性及其評(píng)定,生殖毒性的評(píng)價(jià),,,生殖毒性試驗(yàn)的特殊性,毒性表現(xiàn)形式的多樣性、延續(xù)性和滯后性 動(dòng)物交配和分娩時(shí)間的非同步性 多層次分組（給藥組及檢測(cè)指標(biāo)亞組） 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的多樣性

36、 窩效應(yīng)和窩大小的不均一性,,數(shù)據(jù)采集、處理和分析的準(zhǔn)確可靠性,,計(jì)算機(jī)管理系統(tǒng),（二）體內(nèi)預(yù)篩試驗(yàn)（C.K試驗(yàn)）,又名生殖／發(fā)育毒性篩選試驗(yàn)依據(jù)：大多數(shù)出生前受到的損傷將在出生后表現(xiàn)為存活力下降和／或生長(zhǎng)障礙。因此在仔鼠出生后，觀察其外觀畸形，胚胎致死，生長(zhǎng)遲緩等發(fā)育毒性表現(xiàn)，而不進(jìn)行傳統(tǒng)常規(guī)試驗(yàn)中內(nèi)臟和骨骼的檢查，就可達(dá)到篩選的目的。 優(yōu)點(diǎn)：所用動(dòng)物少，檢測(cè)終點(diǎn)少，實(shí)驗(yàn)周期短，能提供有關(guān)化學(xué)物對(duì)生殖和／或發(fā)育可能發(fā)生影響的初

37、步信息。,1、化學(xué)物致畸潛力分類和安全系數(shù)確定 根據(jù)動(dòng)物試驗(yàn)中發(fā)育毒性效應(yīng)的類型、嚴(yán)重性和發(fā)生率將化學(xué)物分為四類，并規(guī)定各類型的不同的安全系數(shù)范圍，用以評(píng)定待測(cè)物發(fā)育毒性的危險(xiǎn)度。,國(guó)際生命科學(xué)院(International Life Sciences Institute,ILSI) 提出,,2、ICH人類用藥危險(xiǎn)度分類: ICH：人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)。 ICH 在研究設(shè)計(jì)中規(guī)定：被批準(zhǔn)的新藥要根據(jù)動(dòng)物發(fā)育毒性

38、的研究結(jié)果和從人類使用經(jīng)驗(yàn)得到的信息，將該藥品在妊娠用藥類別中定位，并要求醫(yī)生在開處方時(shí)遵守，以使懷孕婦女按規(guī)定使用這些藥品。,A、B、C2：僅在如果明顯地需要時(shí)，在懷孕期間可使用。C1：僅在如果證明可能的效益與對(duì)胎兒的可能的危險(xiǎn)比較是可 取時(shí)，在懷孕期間可使用。D：如果在懷孕期間使用，應(yīng)通知病人對(duì)胎兒可能的危害。X：在懷孕或可能懷孕的婦女中禁止使用。,,3、根據(jù)動(dòng)物試驗(yàn)人群調(diào)查資料對(duì)致畸物分級(jí),根據(jù)歐共體（EE

39、C）和經(jīng)濟(jì)與發(fā)展組織（OECD）建議,,4、確認(rèn)人類致畸物的標(biāo)準(zhǔn)(1)一種特殊的缺陷或幾種缺陷并發(fā)(綜合征)頻率突然增加。(2)缺陷的增加與某種已知的環(huán)境改變相交聯(lián)，如一種新藥的廣泛使用巧合。(3)已知在妊娠的特殊階段暴露于接觸環(huán)境的改變，產(chǎn)生有特征性缺陷的綜合征。(4)缺少妊娠時(shí)引起特征性缺陷嬰兒產(chǎn)生的其他共同的因子。,已知的人類致畸物,電離輻射：放射治療、放射性碘、原子武器感染：風(fēng)疹、巨細(xì)胞病毒、單純性皰疹、梅毒、弓形體病

40、毒代謝失調(diào)：克汀病、糖尿病、苯丙酮酸尿、男性化腫瘤、高溫 藥物和化學(xué)品： 反應(yīng)停、 Abameetin、 酒精、 氨基蝶呤、 雄性激素、麻 醉劑、抗甲狀腺藥物、白消安、咖啡因、氯代聯(lián)苯類、香豆素抗凝劑、環(huán)磷酰胺、二已基乙烯雌酚、敵螨普、三氟氯溴乙烷 、異維A酸、鋰、甲巰咪唑、有機(jī)汞化合物、有機(jī)溶劑類、苯妥因、腐霉利、四環(huán)素、三甲惡唑烷二酮、丙(基)戊酸,,黃芪甲苷對(duì)SD大鼠和 兔致畸性的研究,前 言,?

41、黃芪甲苷是黃芪的重要生理活性成分，常作為黃芪藥材的定性定量指標(biāo)。 ?降壓消炎，鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛，影響血清和肝臟蛋白質(zhì)合成，影響血漿cAMP及再生肝DNA合成，促進(jìn)NK細(xì)胞(自然殺傷細(xì)胞)活性及抗肝損傷,?為提高該功能因子在食品中應(yīng)用的安全性，了解黃芪甲苷是否具有胚胎毒性、胎兒毒性和致畸性。?采用嚙齒類和非嚙齒類兩類動(dòng)物，對(duì)其進(jìn)行了致畸敏感期毒性試驗(yàn)，為該功能因子的毒性評(píng)價(jià)提供臨床前資料。,受 試 物,名 稱：黃芪甲苷（原料藥）批

42、 號(hào)：030510劑 型：淡黃色液體，10mg/ml溶 劑:生理鹽水1/4稀釋的1:1丙二醇:乙醇,材料與方法,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,SD大鼠:購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（津）2003－0002， 孕兔:由天津醫(yī)科大學(xué)提供，動(dòng)物合格證號(hào)： SCXK（津）2003－0008,材料與方法,劑量選擇,SD大鼠：0.25,0.5和1.0 mg?kg-1體重3個(gè)劑量組，每組至少20只孕鼠，于GD6－G

43、D15按10 ml／kg體重連續(xù)尾靜脈注射給藥。兔：0.5,1.0和2.0mg·kg－1。 每組12只以上孕兔。于GD8-GD17連續(xù)耳緣靜脈給藥。溶劑對(duì)照組：生理鹽水1/4稀釋的1:1丙二醇:乙醇,材料與方法,試驗(yàn)方法: 大鼠標(biāo)準(zhǔn)致畸試驗(yàn)和兔致畸敏感期試驗(yàn)觀察指標(biāo): 給藥期間觀察一般毒性，分娩前一天剖殺動(dòng)物（大鼠GD20,兔GD30），觀察母體孕期體重變化,黃體數(shù)、活胎率、死胎率、吸收胎率，胎兒身長(zhǎng)、體重

44、和胎盤重,胎兒外觀和內(nèi)臟畸形、以及骨骼的發(fā)育情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法: 應(yīng)用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件，均數(shù)的比較用方差分析。,材料與方法,黃芪甲苷對(duì)母體的影響,孕期增重:GD20體重與GD0體重的差值，SD大鼠：1.0 mg?kg-1劑量時(shí)孕鼠增重與對(duì)照組比較明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明在此劑量下黃芪甲苷對(duì)SD大鼠有一定的母體毒性。新西蘭兔：黃芪甲苷在0.5mg·kg－1，1.0mg·kg－1和，2.0mg

45、·kg－1劑量下孕期增重與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)新西蘭兔無(wú)母體毒性,結(jié) 果,黃芪甲苷的胚胎毒性,活胎率、死胎率和吸收胎率SD大鼠：在1.0 mg·kg－1劑量時(shí)活胎率和死胎率與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表現(xiàn)為活胎率降低和死胎率升高，表明在1.0 mg·kg－1劑量時(shí)對(duì)SD大鼠有一定胚胎毒性。,結(jié) 果,新西蘭兔：各受試劑量下活胎率與對(duì)照組比較均有差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表現(xiàn)為各劑量

46、組活胎率降低，中、低劑量下吸收胎率和高劑量下死胎率升高，與對(duì)照組比較有差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明黃芪甲苷在受試劑量下對(duì)新西蘭兔具有一定的胚胎毒性。,黃芪甲苷的胎兒毒性,胎兒身長(zhǎng)、體重和胎盤重SD大鼠：胎鼠身長(zhǎng)在受試劑量下與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在0.25 mg·kg－1和0.5 mg·kg－1劑量組胎鼠體重和胎盤重略低于對(duì)照組，但無(wú)明顯劑量－反應(yīng)趨勢(shì)；表明黃芪甲苷在受試劑量下對(duì)胎鼠無(wú)胎兒毒性。,結(jié) 果,

47、胎兔：在受試劑量下體重、身長(zhǎng)和胎盤重與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；表明黃芪甲苷在受試劑量下對(duì)胎兔無(wú)胎兒毒性。,黃芪甲苷對(duì)胎兒骨骼發(fā)育的影響,觀察了胎兒的尾椎數(shù)、骶椎數(shù)/薦椎數(shù)、胸骨節(jié)數(shù)、掌骨數(shù)、近端指骨數(shù)、遠(yuǎn)端指骨數(shù)、跖骨數(shù)、近端趾骨數(shù)、遠(yuǎn)端趾骨數(shù)、胸骨骨化不全和胸骨缺失的情況。,結(jié) 果,發(fā)現(xiàn)在受試劑量下，胎鼠和胎兔尾椎數(shù)、骶椎數(shù)、胸骨節(jié)數(shù)、掌骨數(shù)、近端指骨數(shù)、遠(yuǎn)端指骨數(shù)、跖骨數(shù)、近端趾骨數(shù)、遠(yuǎn)端趾骨數(shù)、胸骨骨化不全和胸骨缺失與

48、對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性，表明黃芪甲苷在各受試劑量下對(duì)胎鼠和胎兔的發(fā)育明顯無(wú)影響。,黃芪甲苷的致畸性,胎鼠：在受試各劑量組均未觀察到明顯的骨骼、外觀和內(nèi)臟畸形。胎兔：對(duì)照組、低劑量組和高劑量組出現(xiàn)外觀畸形，對(duì)照組和高劑量組有一只出現(xiàn)內(nèi)臟畸形。但外觀畸形、內(nèi)臟畸形和骨骼畸形率與對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異。黃芪甲苷對(duì)SD大鼠和新西蘭兔無(wú)致畸作用,結(jié) 果,,,中劑量組：腦外觀腫脹，前肢內(nèi)翻,,,右前肢外翻，左前肢內(nèi)翻,腹部膨隆，打開腹

49、腔后發(fā)現(xiàn)胃內(nèi)有大量積液,,,高劑量組：左右心室肥大,結(jié) 論,母體毒性：研究結(jié)果表明，黃芪甲苷在1.0 mg?kg-1以上劑量時(shí)對(duì)SD大鼠具有一定的母體毒性，而對(duì)新西蘭兔在受試劑量下均無(wú)母體毒性出現(xiàn)。表明在母體毒性方面對(duì)SD大鼠較敏感胚胎毒性：SD大鼠在1.0 mg?kg-1以上劑量時(shí)出現(xiàn)活胎率降低死胎率增高現(xiàn)象，而新西蘭兔在0.5 mg?kg-1劑量時(shí)即出現(xiàn)胚胎毒性，兩種種屬的動(dòng)物均出現(xiàn)胚胎毒性，這表明黃芪甲苷對(duì)胚