基因工程基本過(guò)程

1、基因工程基本過(guò)程基因工程基本過(guò)程基因工程基因工程（geicengineering），也叫基因操作、遺傳工程，或重組體DNA技術(shù)。它是一項(xiàng)將生物的某個(gè)基因通過(guò)基因載體運(yùn)送到另一種生物的活性細(xì)胞中，并使之無(wú)性繁殖（稱之為“克隆“）和行使正常功能（稱之為“表達(dá)“），從而創(chuàng)造生物新品種或新物種的遺傳學(xué)技術(shù)。一般說(shuō)來(lái)，基因工程是專指用生物化學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA片段）與載體系

2、統(tǒng)（病毒、細(xì)菌質(zhì)粒或噬菌體）的DNA結(jié)合成一個(gè)復(fù)制子。這樣形成的雜合分子可以在復(fù)制子所在的宿主生物或細(xì)胞中復(fù)制，繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、生長(zhǎng)和篩選轉(zhuǎn)化子，無(wú)性繁殖使之成為克隆。然后直接利用轉(zhuǎn)化子，或者將克隆的分子自轉(zhuǎn)化子分離后再導(dǎo)入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)體系，使重組基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生特定的基因產(chǎn)物。常用的工具酶工具酶限制性內(nèi)切酶—主要用于DNA分子的特異切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸連接酶—用于DNA和RNA的連接核酸聚合酶

3、—用于DNA和RNA的合成核酸酶—用于DNA和RNA的非特異性切割核酸末端修飾酶—用于DNA和RNA的末端修飾其它酶類用于生物細(xì)胞的破壁、轉(zhuǎn)化、核酸純化、檢測(cè)等。主要過(guò)程有為四步：1獲得目的基因獲得目的基因有多種方法可獲得目得基因1.構(gòu)建cDNA文庫(kù)分離目的基因過(guò)程：（1）從真核細(xì)胞中提取mRNA，以其為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA的第一條鏈。（2）以第一條鏈為模板，以反轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶Ｉ作用下合成cDNA的第二條鏈。（3）

4、在甲基化酶作用下使cDNA甲基化。在pH值12.0～12.5范圍內(nèi)時(shí)，線性的DNA會(huì)被變性而共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA卻不會(huì)被變性。通過(guò)冷卻或恢復(fù)中性pH值使之復(fù)性，線性染色體形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而cccDNA可以準(zhǔn)確迅速?gòu)?fù)性，通過(guò)離心去除線性染色體，獲得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質(zhì)粒DNA。三構(gòu)建基因表達(dá)載體三構(gòu)建基因表達(dá)載體1.用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出粘性末端。2.用同一種限制酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生

5、相同的黏性末端。3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個(gè)重組DNA分子（重組質(zhì)粒）。四目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞四目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞－農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞－顯微注射法3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞（以大腸桿菌為例）（1）用Ca2處理細(xì)胞以增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞.（2）將重組表達(dá)載體DNA分子溶

6、于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子完成轉(zhuǎn)化過(guò)程.（3）目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)，隨其繁殖而復(fù)制，由于細(xì)菌繁殖的速度非?？?，在很短的時(shí)間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。五目的基因的檢測(cè)與鑒定五目的基因的檢測(cè)與鑒定1.要檢測(cè)目的基因是否插入轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上檢測(cè)方法：采用DNA分子雜交技術(shù)2.檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄了mRNA檢測(cè)方法：同樣用分子雜交技術(shù)DNA與RNA雜交3.檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)檢測(cè)方法：