基因工程筆記

1、基因工程課程筆記創(chuàng)建于2014.10.31第1頁(yè)共35頁(yè)緒論緒論第一節(jié)基因工程的誕生第二節(jié)基因工程的安全性第三節(jié)基因工程的應(yīng)用第四節(jié)基因工程技術(shù)的商業(yè)化發(fā)展一、定義※GeicGeicengineeringengineering：?在體外將核酸分子?插入病毒質(zhì)?；蚱渌d體系統(tǒng)中構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合?再整合到那些本來(lái)不含該類物質(zhì)的宿主中?從而形成一種新的可連續(xù)繁殖的有機(jī)體＆就是有意識(shí)地把一個(gè)生物體中有用的目的基因轉(zhuǎn)入另一個(gè)生物體中，使后者獲

2、得新的遺傳性狀或表達(dá)所需要的產(chǎn)物?！鵆lone:從一個(gè)共同祖先無(wú)性繁殖下來(lái)的一群遺傳上同一的DNA分子、細(xì)胞或個(gè)體所組成的特殊的生命群體。二、特征特征1.跨物種性外源基因到另一種不同的生物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行繁殖。2.無(wú)性擴(kuò)增外源DNA在寄主細(xì)胞內(nèi)可大量擴(kuò)增，和高水平表達(dá)。三、基因工程的主要操作內(nèi)容三、基因工程的主要操作內(nèi)容（供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件）1.目的基因的獲取：從復(fù)雜的生物基因組中，經(jīng)過(guò)酶切消化或PCR擴(kuò)增等步驟，

3、分離出帶有目的基因的DNA片斷。片斷。2.重組體的制備：將目的基因的DNA片斷插入到能自我復(fù)制并帶有選擇性標(biāo)記（抗菌素抗性）的載體分子上。3.重組體的轉(zhuǎn)化將重組體（載體）轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中。4.克隆鑒定:挑選轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞克?。ê心康幕颍?.目的基因表達(dá):使導(dǎo)入寄主細(xì)胞的目的基因表達(dá)出我們所需要的基因產(chǎn)物。安全性安全性一、基因工程的安全措施（1）實(shí)驗(yàn)室的物理安全）實(shí)驗(yàn)室的物理安全①P1級(jí)實(shí)驗(yàn)室一般裝備良好的普通微生物實(shí)驗(yàn)室。②P2

4、級(jí)實(shí)驗(yàn)室在P1級(jí)實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)上還裝備有負(fù)壓的安全操作柜?；蚬こ陶n程筆記創(chuàng)建于2014.10.31第3頁(yè)共35頁(yè)染色體線性染色體線性DNADNA和或有缺口的質(zhì)粒和或有缺口的質(zhì)粒DNADNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)構(gòu)，與蛋白質(zhì)—SDSSDS復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時(shí)候沉淀下去。復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時(shí)候沉淀下去。所用的試劑作用所用的試劑作用①溶菌酶能水解菌體細(xì)胞壁的主要

5、化學(xué)成分肽聚糖中的?1，4糖苷鍵。在堿性條件（pH8）下有活性②葡萄糖增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械力（震蕩）的作用而降解③EDTAMg2、Ca2的螯合劑，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。④NaOHSDSNaOH：強(qiáng)堿，提供pH12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。SDS:溶解細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)蛋白，并結(jié)合成“蛋白—SDS”復(fù)合物，使蛋白質(zhì)（包括DNA酶）變性沉淀。⑤NaAcHAc緩沖液冰醋酸把醋酸鈉溶液的pH調(diào)到4

6、.8。用來(lái)中和NaOH變性液，使DNA復(fù)性，高濃度的NaAc有利于變性的大分子（蛋白質(zhì)、DNA、RNA等）沉淀⑥乙醇用于沉淀DNA，DNA分子以水合狀態(tài)“溶于”水里，乙醇能奪去DNA分子的水環(huán)境。⑦RNaseA降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。⑧TE緩沖液：DNA保存液。由TrisHCl和EDTA配制TrisHCl不含金屬離子（不同于磷酸緩沖液或硼酸緩沖液），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解

7、⑨酚氯仿（選用選用）蛋白變性劑，進(jìn)一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。但苯酚會(huì)殘留在DNA溶液中。提取質(zhì)粒提取質(zhì)粒DNADNA的步驟的步驟溶菌溶菌破膜破膜蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)和DNADNA變性變性中和中和離心除去沉淀離心除去沉淀純化純化DNADNA沉淀沉淀DNADNA溶菌：使用溶菌：使用“溶液Ⅰ溶液Ⅰ”溶解細(xì)菌細(xì)胞壁。溶解細(xì)菌細(xì)胞壁。溶液Ⅰ：溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mMTrisHCl(pH8.0)，10mMEDTA，45mgml溶

8、菌酶，RNaseA溶液溶液IIII0.2NNaOH，1.0%SDS溶液溶液IIIIII3M醋酸鈉（用冰醋酸調(diào)pH至4.8）影響質(zhì)粒影響質(zhì)粒DNADNA產(chǎn)量的因素產(chǎn)量的因素◆菌株的遺傳背景，◆質(zhì)粒自身的拷貝數(shù)DNADNA的定量和純度測(cè)定的定量和純度測(cè)定1.紫外光譜法（DNA（或RNA）在260nm波長(zhǎng)處有特異的紫外吸收峰。蛋白質(zhì)280）2.瓊脂糖凝膠電泳估計(jì)（溴化乙錠（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能發(fā)紅色熒光與已知濃度的DNA電