外源p204對斑馬魚先天免疫的影響和p204轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建.pdf

1、天然免疫和適應(yīng)性免疫共同組成了動物的免疫系統(tǒng)。天然免疫是機體防御病原微生物感染的第一道防線，在天然免疫系統(tǒng)中最重要的一環(huán)就是模式識別受體PRRs對病原微生物模式相關(guān)分子PAMPs的識別。TLR是重要的胞外和胞內(nèi)受體，參與到NF-κB和IRF激活的信號通路，引起機體的炎癥反應(yīng)和抗病毒反應(yīng)。天然免疫和適應(yīng)性免疫不是獨立的兩個系統(tǒng)，相反，天然免疫的重要分子和信號通路可以激活適應(yīng)性免疫。在這個機制中，TLRs信號通路是聯(lián)系天然免疫與適應(yīng)性免疫的

2、紐帶。
　　 斑馬魚與人類一樣具有天然免疫和適應(yīng)性免疫。對斑馬魚適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的研究已有多年，取得了重要的研究成果，研究技術(shù)也有很大的提高。然而，對斑馬魚天然免疫系統(tǒng)的研究才剛剛起步。天然免疫系統(tǒng)是機體防御病原微生物感染的第一道防線，而且對適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的激活有重要的影響。因此在斑馬魚中深入研究天然免疫系統(tǒng)不僅可以促進我們對斑馬魚自身的免疫系統(tǒng)的認識，而且從進化的角度看，也為研究高等脊椎動物免疫系統(tǒng)提供思路和工具。并且斑馬魚因其

3、個體小、易于飼養(yǎng)、性成熟周期短、易繁殖和繁殖率高、胚胎透明易觀察、便于胚胎操作等優(yōu)勢，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因功能的相關(guān)研究。
　　 本研究以斑馬魚為動物模型，采用顯微注射的方式將外源的p204質(zhì)粒導(dǎo)入斑馬魚受精卵中，通過觀察報告基因GFP的熒光表達，發(fā)現(xiàn)p204在斑馬魚胚胎中從8hpf開始表達，表達位置主要集中在斑馬魚的胸腹部，在8hpf-8dpf時期p204大量表達，8dpf后p204的表達量會逐漸減少，直至11dpf左右發(fā)現(xiàn)熒光

4、完全消失。p204-EGFP質(zhì)粒注射后導(dǎo)致斑馬魚表型變化，產(chǎn)生畸形，出現(xiàn)腹部變大、尾部彎曲等狀況。
　　 對注射后的斑馬魚胚胎，選取其中表達綠色熒光的胚胎進行實時定量PCR檢測，檢測先天免疫相關(guān)的基因tbk(l)和sting,通過實時定量檢測，發(fā)現(xiàn)p204注射后能夠引起相應(yīng)的先天免疫相關(guān)基因tbk(l)和sting達量在8hpf-48hpf階段比對照組都有明顯上調(diào)，而之前4hpf階段的表達量并沒有明顯變化。另外進行了相應(yīng)基因的原

5、位雜交檢測，其結(jié)果與實時定量結(jié)果相吻合。為了能夠獲得p204整合進入斑馬魚基因組中的突變體，我們利用tol2轉(zhuǎn)座子攜帶p204，構(gòu)建tol2-p204的載體，并將其和TP轉(zhuǎn)座酶一起共注射到斑馬魚受精卵中。研究結(jié)果表明:1.外源p204基因可以在一定程度上影響斑馬魚的發(fā)育，造成斑馬魚的畸形;2.p204能夠影響斑馬魚先天免疫，參與相關(guān)信號通路;3.tol2-p204載體構(gòu)建成功，并且導(dǎo)入斑馬魚受精卵中，但p204在斑馬魚體內(nèi)的表達不夠穩(wěn)定