木鱉子對羥基桂皮醛誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞分化的實驗研究.pdf

1、目的:研究從中藥木鱉子中提取的九種單體化合物對小鼠黑色素瘤細(xì)胞生長的影響，篩選出作用效果最顯著的單體化合物;從形態(tài)及功能方面觀察對羥基桂皮醛誘導(dǎo)B16細(xì)胞分化的作用;并從基因及蛋白水平探討其作用機制，為其作為抗腫瘤新藥開發(fā)提供參考依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.從不鱉子中提取對羥基桂皮醛、松柏醛、對羥基苯甲醛、3-甲氧基對羥基苯甲醛和ligballinol等九種單體化合物;采用SRB法檢測九種單體化合物對B16細(xì)胞生長的

2、影響，計算生長抑制率，并在光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。
　　 2.SRB法檢測不同濃度對羥基桂皮醛（2、4、6肛g/ml）作用24h、48h、72h后，對B16細(xì)胞增殖的抑制作用。
　　 3.采用瑞-姬染色法觀察不同濃度對羥基桂皮醛（2、4、6μg/ml）作用于B16細(xì)胞72h后，對細(xì)胞形態(tài)的影響。
　　 4.比色法檢測6μg/ml對羥基桂皮醛作用于B16細(xì)胞48h后，對細(xì)胞黑色素含量和酪氨酸酶活性的影響。
　

3、　 5.采用生長曲線的方法檢測6μg/ml對羥基桂皮醛作用于B16細(xì)胞48h后，對細(xì)胞增殖能力的影響。
　　 6.采用克隆集落形成試驗檢測6μg/ml對羥基桂皮醛作用于B16細(xì)胞48h后，對細(xì)胞克隆增殖能力的影響。
　　 7.采用劃痕試驗檢測6μg/ml對羥基桂皮醛作用于B16細(xì)胞48h后，對細(xì)胞遷徙能力的影響。
　　 8.采用流式細(xì)胞(Flowcytometry,FCM)檢測6μg/ml對羥基桂皮醛作用于B1

4、6細(xì)胞6h、12h、24h和48h后，對細(xì)胞凋亡率以及細(xì)胞周期分布的影響。
　　 9.采用免疫印跡技術(shù)(Westernblot)檢測MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中p-P38、p-JNK和p-ERK1/2在對羥基桂皮醛誘導(dǎo)B16細(xì)胞分化過程中的作用。
　　 10.通過Realtime方法檢測6μg/ml的對羥基桂皮醛分別作用于B16細(xì)胞6h、12h、24h后，分化相關(guān)基因c-myc、Tyr、Trp1和Trp2表達(dá)的變化。
　

5、　 結(jié)果:
　　 1.對羥基桂皮醛、松柏醛、對羥基苯甲醛、3-甲氧基對羥基苯甲醛和ligballinol等九種單體化合物對B16細(xì)胞的生長有不同程度的抑制作用，其中對羥基桂皮醛的效果最明顯，與各組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.對羥基桂皮醛（2、4、6μg/ml）對B16細(xì)胞的增殖有較強的抑制作用，且具有濃度和時間相關(guān)性，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.Giem

6、sa染色結(jié)果顯示，2μg/ml對羥基桂皮醛作用72h后，細(xì)胞體積增大變成梭形，排列有序，成纖維狀生長。隨著對羥基桂皮醛藥物濃度的增大，細(xì)胞出現(xiàn)樹突狀結(jié)構(gòu)，為典型的細(xì)胞分化形態(tài);而對照組細(xì)胞大小均勻，生長密集。
　　 4.B16細(xì)胞經(jīng)2、4、6μg/ml的對羥基桂皮醛分別作用48時后，隨著藥物作用濃度的增大，黑色素含量和酪氨酸酶活性增加，且明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 5.B16細(xì)胞經(jīng)6μg/

7、ml的對羥基桂皮醛作用48時后，生長增殖能力降低，且明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 6.B16細(xì)胞經(jīng)6μg/ml的對羥基桂皮醛作用48時后，克隆集落形成能力降低，且明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 7.B16細(xì)胞經(jīng)6μg/ml的對羥基桂皮醛作用48時后，遷徙力降低，且明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 8.FCM分析結(jié)果顯示，6μg/m

8、l對羥基桂皮醛作用于B16細(xì)胞6、12、24、48h后，細(xì)胞凋亡率無明顯改變，但處于S期、G2/M期細(xì)胞減少，G0/G1期細(xì)胞明顯增加，與對照組相比有顯著差異。組間比較差異有顯著性(P＜0.05)，各實驗組與對照組比較差異有顯著性(P＜0.01)。
　　 9.Westernblot結(jié)果顯示，對羥基桂皮醛還可以上調(diào)MAPK信號通路中p-P38和下調(diào)p-JNK和p-ERK的蛋白表達(dá)水平(P＜0.05）。
　　 10.Real

9、time檢測結(jié)果顯示，對羥基桂皮醛可以上調(diào)Tyr、Trp1和Trp2和下調(diào)c-myc基因的表達(dá)水平(P＜0.05），進一步證實對羥基桂皮醛是通過上調(diào)酪氨酸酶的表達(dá)而誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞黑色素含量的增加，同時下調(diào)腫瘤形成相關(guān)基因c-myc的表達(dá)水平而促進B16細(xì)胞的分化。
　　 結(jié)論:
　　 1.木鱉子九種單體化合物中，第一種單體化合物對羥基桂皮醛的抗腫瘤作用最強，誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞形態(tài)方面的分化。
　　 2.