木鱉子對羥基桂皮醛通過調(diào)控cAMP-RhoA-MAPK途徑誘導(dǎo)食管鱗狀細(xì)胞癌分化作用研究.pdf

1、第一部分：CMSP對ESCC細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用
　　目的：
　　本課題通過研究木鱉子乙醇提取物對羥基桂皮醛(p-Hydrox-ylcinnamaldehyde,CMSP)對ESCC細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及腫瘤標(biāo)志蛋白表達(dá)水平等方面的影響，探討CMSP對ESCC細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用。通過以上研究為CMSP作為分化誘導(dǎo)劑應(yīng)用于食管癌的臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.MTS法檢測不同濃度CMSP分別作用不同時(shí)間

2、，對ESCC細(xì)胞(Kyse30、TE-13、Eca109及Kyse180)及正常食管上皮細(xì)胞株HEEC增殖活性的影響。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測不同濃度CMSP分別作用于ESCC細(xì)胞株Kyse30及TE-13后，對細(xì)胞周期分布及凋亡水平的影響。
　　3.在光鏡及電鏡下分別觀察CMSP作用后，對Kyse30及TE-13形態(tài)的影響。
　　4.通過實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse

3、 transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和ELISA技術(shù)分別從mRNA及蛋白分泌水平檢測CMSP對Kyse30及TE-13表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原CEA、SCC及腫瘤標(biāo)志物IL-6、MIC-1水平的影響。
　　5.通過Western blotting技術(shù)檢測CMSP對Kyse30及TE-13腫瘤標(biāo)志物C-myc及N-myc蛋白表達(dá)水平的影響。
　　6

4、.通過克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測CMSP對Kyse30及TE-13細(xì)胞克隆形成能力的影響；并通過 Transwell小室及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測CMSP對Kyse30及TE-13細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響。同時(shí)采用Western blotting技術(shù)檢測CMSP對Kyse30及TE-13細(xì)胞中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)蛋白MMP2、E-cadherin、N-cadherin及Vimen

5、tin表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果：
　　1.CMSP可呈劑量及時(shí)間依賴性抑制ESCC細(xì)胞株(Kyse30、TE-13、Eca109及Kyse180)的增殖活性(P<0.01)，但對正常食管上皮細(xì)胞株HEEC增殖活性無明顯抑制作用(P>0.05)。
　　2.0-40μg/ml CMSP作用后，Kyse30及TE-13中周期阻滯于G0/G1期的細(xì)胞比例明顯增高(P<0.01)，但10-40μg/ml CMSP作用后，Ann

6、exin V-FITC表達(dá)陽性細(xì)胞比例無明顯變化，因此提示CMSP對ESCC細(xì)胞的抑制作用不依賴于誘導(dǎo)凋亡(P>0.05)。
　　3.CMSP作用后，Kyse30及TE-13細(xì)胞可呈明顯梭形改變，且梭形細(xì)胞比例隨著CMSP濃度的增高而增加(P<0.01)。
　　4.CMSP作用后，Kyse30及TE-13細(xì)胞中CEA、SCC、IL-6、MIC-1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平均明顯下降，且該作用可呈明顯劑量及時(shí)間依賴性(P<0.

7、05)。
　　5.CMSP作用后，Kyse30及TE-13細(xì)胞中C-myc及N-myc蛋白的表達(dá)水平均明顯下降，且該作用可呈明顯劑量及時(shí)間依賴性(P<0.05)。
　　6.與CMSP共培養(yǎng)的Kyse30和TE-13細(xì)胞，其克隆形成及遷移、侵襲能力均明顯下降(P<0.05)，同時(shí)，細(xì)胞中MMP2及腫瘤細(xì)胞間質(zhì)型標(biāo)志Vimentin、N-cadherin的表達(dá)水平均明顯下降(P<0.01)，而上皮型標(biāo)志E-cadherin的表達(dá)

8、水平明顯增加(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.CMSP可明顯抑制ESCC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及克隆形成能力，并可顯著抑制ESCC細(xì)胞中腫瘤相關(guān)抗原及腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)水平。
　　2.CMSP可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞分化，而非誘導(dǎo)凋亡作用抑制ESCC細(xì)胞的生物活性。
　　3.CMSP對正常食管上皮細(xì)胞株HEEC無明顯抑制作用，因此提示該藥可能具有較小的毒副作用。
　　第二部分：CMSP對ESCC細(xì)胞分化誘導(dǎo)作用

9、的機(jī)制研究
　　目的：
　　深入探討CMSP誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞分化的作用機(jī)制，為CMSP應(yīng)用于ESCC的綜合治療提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.采用同位素相對標(biāo)記與絕對定量質(zhì)譜技術(shù)(Relative isotopic labeling and absolute quantification,iTRAQ)分析CMSP作用后Kyse30細(xì)胞中表達(dá)程度變化(>3倍)的蛋白，并對表達(dá)水平變化的蛋白進(jìn)行GO(Gene O

10、ntology)及Pathway分析，篩選 CMSP可能作用的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，初步研究CMSP對ESCC細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用的可能機(jī)制。
　　2.ELISA實(shí)驗(yàn)檢測CMSP對Kyse30及TE-13細(xì)胞中cAMP表達(dá)水平的影響。
　　3.采用Western blotting技術(shù)檢測CMSP對Kyse30及TE-13中RhoA、P-38、p-P38、ERK1/2、p-ERK1/2、SAPK/JNK及p-SAPK/JNK表達(dá)水平

11、的影響。
　　4.Pull down技術(shù)檢測CMSP對Kyse30及TE-13中GTP-RhoA表達(dá)水平的影響。
　　5.為深入探討CMSP誘導(dǎo) ESCC細(xì)胞分化作用的機(jī)理，我們還觀察了cAMP活性抑制劑SQ22536對CMSP誘導(dǎo)Kyse30及TE-13分化作用的影響。
　　6.分別觀察cAMP活性促進(jìn)劑Forskolin、ERK途徑抑制劑PD98059及JNK途徑抑制劑SP600125作用后，Kyse30及TE-1

12、3生物活性的變化，探討Forskolin、PD98059及SP600125對ESCC細(xì)胞分化作用的影響。
　　結(jié)果：
　　1.iTRAQ分析結(jié)果顯示CMSP作用后，Kyse30細(xì)胞中有79中蛋白表達(dá)水平下降，而103種蛋白表達(dá)水平增高，經(jīng)過GO及Pathway分析，我們發(fā)現(xiàn)其中能注釋到的蛋白共176種，這些蛋白參與了細(xì)胞多種生命活動以及生物化學(xué)反應(yīng)過程，且涉及了CMSP作用后ESCC細(xì)胞中肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、cAMP、胰島

13、素、剪接體、MAPK及Rho等多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　2.CMSP作用后，Kyse30及TE-13細(xì)胞中cAMP、p-P38的表達(dá)水平均明顯上升(P<0.05)，而GTP-RhoA、p-ERK1/2及p-SAPK/JNK的表達(dá)水平均明顯下降(P<0.05)。
　　3.cAMP抑制劑SQ22536作用后，CMSP對Kyse30及TE-13細(xì)胞的增殖抑制及細(xì)胞周期阻滯作用均明顯減弱(P<0.01)；SQ22536作用后，Kyse

14、30及TE-13細(xì)胞中CEA、SCC、IL-6、MIC-1,C-myc及N-myc的表達(dá)水平明顯增高(P<0.01),同時(shí)細(xì)胞 GTP-RhoA、p-ERK1/2及p-SAPK/JNK的表達(dá)水平均明顯增高(P<0.01)，但 p-P38的表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05)。
　　4.Forskolin、PD98059及 SP600125分別作用后，均可對Kyse30及TE-13細(xì)胞產(chǎn)生類似于CMSP的誘導(dǎo)分化作用。
　　因此

15、，對cAMP-RhoA-ERK/JNK通路的調(diào)控作用可能是CMSP誘導(dǎo)ESCC分化作用的主要機(jī)制，但P38通路在CMSP分化誘導(dǎo)中的作用及其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。
　　結(jié)論：
　　CMSP對ESCC細(xì)胞的分化誘導(dǎo)能力與該藥作用后影響cAMP-RhoA-MAPK通路的活性有關(guān)，CMSP作用后，表達(dá)水平增高的cAMP通過抑制RhoA活化，進(jìn)而抑制ERK/JNK途徑的活性可能是CMSP對ESCC細(xì)胞誘導(dǎo)分化作用的主要機(jī)制。

16、r>　　第三部分：CMSP抑制食管癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的作用及機(jī)制研究
　　目的：
　　構(gòu)建裸鼠食管癌Kyse30細(xì)胞荷瘤裸鼠模型，研究CMSP在體內(nèi)環(huán)境中對ESCC細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用，以探討CMSP對ESCC細(xì)胞體內(nèi)生物活性的影響。
　　方法：
　　1.通過皮下結(jié)合尾靜脈注射法構(gòu)建裸鼠食管癌Kyse30細(xì)胞荷瘤肺轉(zhuǎn)移Balb-c/null裸鼠模型，實(shí)驗(yàn)分為5組，第11 d開始瘤旁注射藥物，對照組：每3 d瘤旁注

17、射滅菌100μl PBS；CMSP低劑量組：每3 d瘤旁注射100μl CMSP(10 mg/kg體重)；CMSP高劑量組：每3 d瘤旁注射100μl CMSP(20 mg/kg體重)；ATRA治療組：每3 d瘤旁注射100μl ATRA(10-2 mmol/kg體重)；CDDP治療組：每3 d瘤旁注射100μl CDDP(2 mg/kg體重)。第32 d引頸處死各組裸鼠。
　　2.觀察各組裸鼠移植瘤的生長速度及瘤重。
　　

18、3.免疫組化及 Pull down技術(shù)研究各組裸鼠瘤組織中腫瘤標(biāo)志物C-myc、N-myc，EMT相關(guān)蛋白MMP2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin及GTP-RhoA、p-ERK1/2、p-SAPK/JNK的表達(dá)水平。
　　4.ELISA實(shí)驗(yàn)檢測裸鼠外周血中腫瘤分化相關(guān)抗原(CEA及SCC)及腫瘤標(biāo)志物(IL-6及MIC-1)的含量。
　　5.HE染色觀察肺組織轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)的形成。
　　6.H

19、E染色觀察肝、脾、腎等重要臟器的病理改變以評價(jià)CMSP對機(jī)體的毒副作用。
　　結(jié)果：
　　1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CDDP、ATRA及不同濃度CMSP處理組裸鼠腫瘤組織的體積和瘤重均明顯低于對照組(P<0.05)，且CMSP處理組瘤組織中未見明顯的凋亡與壞死灶，這與 ATRA處理組瘤組織的表現(xiàn)是一致的；而CDDP組裸鼠瘤組織可見明顯凋亡與壞死灶。
　　2.裸鼠外周血中分泌型腫瘤相關(guān)抗原CEA、SCC及腫瘤標(biāo)志物IL-6、MI

20、C-1的含量均明顯下降(P<0.05)，同時(shí)瘤組織中腫瘤標(biāo)志蛋白C-myc與N-myc蛋白的表達(dá)水平也明顯下降(P<0.01)。
　　3對照組裸鼠肺組織中，光鏡下可見大小不一的ESCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，而 CMSP低、高劑量治療組肺組織中均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移腫瘤結(jié)節(jié)，這提示CMSP在體內(nèi)環(huán)境中也具有明顯抑制腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的功能。
　　4.免疫組化結(jié)果顯示CMSP作用后，腫瘤組織中MMP2及腫瘤間質(zhì)型標(biāo)志蛋白N-cadherin和Vime

21、ntin的表達(dá)水平均明顯降低(P<0.01)，而上皮型標(biāo)志蛋白E-cadherin的表達(dá)水平明顯增加(P<0.01)，因此CMSP在體內(nèi)環(huán)境中依然可通過抑制腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。
　　同時(shí)，免疫組化及Pull down結(jié)果顯示CMSP作用后，腫瘤組織表達(dá)GTP-RhoA、p-ERK1/2、p-SAPK/JNK的水平均明顯減低(P<0.05)。
　　5.裸鼠肝、脾、腎等重要臟器未見明顯組織病理學(xué)改變，提示該藥具有較

22、小的毒副作用。
　　結(jié)論：
　　在體內(nèi)環(huán)境中，CMSP依然可通過分化誘導(dǎo)作用抑制ESCC移植瘤的生長、侵襲活性，進(jìn)一步提示了該藥物在ESCC綜合治療中的廣泛前景。
　　第四部分：CMSP逆轉(zhuǎn)小鼠食管癌前病變進(jìn)程及其免疫調(diào)節(jié)作用研究
　　目的：
　　通過喂食含4NQO飲用水構(gòu)建小鼠食管癌前病變模型，腹腔注射 CMSP觀察其對食管癌前病變及機(jī)體免疫功能的影響，從而深入地探討CMSP對ESCC發(fā)生、發(fā)展過程的影響

23、，為CMSP應(yīng)用于ESCC的綜合防治提供科學(xué)數(shù)據(jù)。
　　1.通過喂食含100μg/ml4NQO飲用水法，構(gòu)建小鼠C57BL/6食管癌前病變模型小鼠，實(shí)驗(yàn)分為空白對照組，模型組，CMSP預(yù)防組，CMSP治療組及ATRA治療組。實(shí)驗(yàn)持續(xù)30 w?？瞻讓φ战M30 w內(nèi)均給予無菌蒸餾水；模型組小鼠在1-15 w給予100μg/ml的4NQO，16-30 w給予無菌蒸餾水；CMSP預(yù)防組小鼠，在1-15 w給予100μg/ml的4NQO，同

24、時(shí)從第1 w起，每周三次腹腔注射CMSP(20 mg/kg體重)；CMSP治療組小鼠，在1-15 w給予100μg/ml的4NQO，同時(shí)從第16 w起，每周三次腹腔注射CMSP(20 mg/kg)；ATRA治療組小鼠，在1-15 w給予100μg/ml的4NQO，同時(shí)從第16 w起，每周三次腹腔注射ATRA(10-2 mmol/kg)。
　　2.實(shí)驗(yàn)過程中，每周三次稱取小鼠體重，并觀察小鼠一般狀態(tài)；處死小鼠后，取各食管組織，通過H

25、E染色觀察各組小鼠食管癌前病變進(jìn)展情況。
　　3.免疫組化、Western blotting及Pull down技術(shù)研究病變組織中腫瘤標(biāo)志物C-myc、N-myc及GTP-RhoA、p-ERK1/2、p-SAPK/JNK的表達(dá)水平。
　　4.ELISA法小鼠外周血中腫瘤分化相關(guān)抗原(CEA及SCC)及腫瘤標(biāo)志物(IL-6及MIC-1)的含量。
　　5.通過MTS法觀察各組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性；ELISA法檢測外周血中

26、IFN-γ、TNF-α及分泌型B7-H4(secretory B7-H4, sB7-H4)含量；FCM檢測小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群狀態(tài)；免疫組化技術(shù)檢測食管病變組織B7-H4、STAT3及p-STAT3的表達(dá)水平，全面評價(jià)CMSP對模型小鼠機(jī)體免疫功能狀態(tài)的影響及其機(jī)制。
　　6.觀察各組小鼠肝、脾、腎等重要臟器的病理改變以評價(jià) CMSP對機(jī)體的毒副作用。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠食管癌前病變模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 CMSP治

27、療組和預(yù)防組小鼠的癌前病變發(fā)生率及病變程度均明顯低于模型對照組小鼠(P<0.05)，一般狀態(tài)也明顯改善，且CMSP預(yù)防組小鼠癌前病變的發(fā)生率和病變程度均明顯低于CMSP治療組(P<0.05)，這提示CMSP對食管癌前病變具有良好的預(yù)防作用。我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)，CMSP治療組與ATRA治療組小鼠的療效無顯著差異(P>0.05)，這進(jìn)一步提示CMSP具有作為分化誘導(dǎo)藥物應(yīng)用于臨床食管癌治療的潛力。
　　2.CMSP預(yù)防組和治療組小鼠外周血中

28、腫瘤相關(guān)抗原CEA與SCC，及腫瘤標(biāo)志物 MIC-1及 IL-6的含量均較模型對照組明顯降低(P<0.01)，病變組織表達(dá)腫瘤標(biāo)志蛋白C-myc及N-myc的表達(dá)水平也均明顯減低(P<0.01)。
　　3.CMSP治療及預(yù)防組小鼠食管組織中GTP-RhoA、p-ERK1/2及p-SAPK/JNK的表達(dá)水平較模型組明顯下降(P<0.05)。
　　4.模型組小鼠隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量、增殖活性及脾臟指數(shù)均明顯下降

29、(P<0.05)，而CMSP治療及預(yù)防組小鼠外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量及其對ConA刺激后的增殖活性均明顯高于模型組(P<0.05)，同時(shí)脾臟指數(shù)也明顯增高(P<0.05)。
　　5.FCM結(jié)果顯示，模型組小鼠隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，其外周血中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及NK細(xì)胞的比例均明顯減低(P<0.01)，而CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例明顯增高，而CMSP治療和預(yù)防組小鼠CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及NK細(xì)胞的比例均明顯高于

30、模型組(P<0.05)，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例則明顯低于模型組(P<0.05)。
　　6.隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，模型組小鼠外周血中sB7-H4、IL-6及MIC-1含量明顯增高(P<0.01)，而IFN-γ及TNF-α含量逐漸下降(P<0.01)；同時(shí)食管組織表達(dá)B7-H4、STAT3及p-STAT3的水平均明顯增加(P<0.01)。
　　CMSP治療及預(yù)防組小鼠外周血中sB7-H4、IL-6及MIC-1含量均較模

31、型組明顯降低(P<0.01)，而IFN-γ及TNF-α含量明顯增高(P<0.01)；同時(shí)食管組織表達(dá)B7-H4、STAT3及p-STAT3的水平均明顯低于模型組小鼠(P<0.01)，故CMSP對食管癌前病變模型機(jī)體免疫功能的促進(jìn)作用可能與其抑制病變組織B7-H4的表達(dá)、從而抑制B7-H4/STAT3通路的表達(dá)有關(guān)。
　　7.CMSP預(yù)防和治療組肝、脾、腎未見任何異常病理改變，進(jìn)一步說明該藥可能具有較小的毒副作用。
　　結(jié)論：