結核分枝桿菌無毒株H37Ra啟動子突變基因的比較分析.pdf

1、目的：通過分析結核分枝桿菌無毒株H37Ra的全基因組序列,并與H37Rv基因組序列比較,發(fā)現一些基因的啟動子區(qū)域發(fā)生了突變,我們利用分枝桿菌啟動子探針載體pMC210,分別構建了結核分枝桿菌H37Ra和H37Rv的六個重要基因(sec、pabB、phoH2、sigC、nrdH、lpdA)的啟動子探針重組載體。利用報告基因lacZ檢測突變前后啟動子的活性變化。同時,確認啟動子突變與其基因轉錄水平的關系,探索結核分枝桿菌H37Ra毒力喪失的

2、內在因為。
　　 方法：利用生物信息學方法預測這六對基因(sec、pabB、phoH2、sigC、nrdH、lpdA)的啟動子區(qū)域,采用PCR技術克隆這六對基因的啟動子,雙酶切后與分枝桿菌啟動子探針載體pMC210對應的雙酶切片段相連,DNA測序證實連接片段正確后,用電穿孔法將重組質粒轉化至恥垢分枝桿菌mc2155中。通過體外測定β-半乳糖苷酶的活性來評估啟動子的強度和Quantitative Real-Time RT-PCR的

3、方法檢測報告基因lacZ的轉錄水平差異,檢測啟動子的突變對相應基因轉錄水平的影響。
　　 結果：通過PCR和構建克隆測序比對發(fā)現基因sec、phoH2、sigC、nrdH的啟動子與GenBank上提交的序列存在差異,結核分枝桿菌無毒株H37Ra和有毒株H37Rv相比較,基因sec、phoH2、sigC、nrdH預測的啟動子并沒有突變。只有基因pabB和lpdA存在啟動子突變。H37Rv和H37Ra的pabB基因的啟動子探針重組載

4、體轉化恥垢分枝桿菌后,體外測定的β-半乳糖苷酶的活性較弱,無統(tǒng)計學意義,而Quantitative Real Time PCR檢測結果顯示H37Ra pabB啟動子調節(jié)報告基因lacZ轉錄的活性是H37Rv pabB啟動子的6倍(p<0.05),H37Rv和H37Ra lpdA啟動子探針重組載體體外測得的β-半乳糖苷酶的活性和Real time PCR結果均顯示H37Rv lpdA啟動子調節(jié)報告基因lacZ表達的活性比H37Ra lpd