基于熒光蛋白的蛋白酶和蛋白激酶檢測新方法.pdf

1、蛋白酶和蛋白激酶普遍存在于生物體內(nèi)并參與各項生命活動，對蛋白酶和蛋白激酶的檢測不僅能使我們更好的理解生命過程，對于人們的生產(chǎn)生活、疾病的診斷治療方面都有著極大的意義。綠色熒光蛋白(GFP)是一種由238個氨基酸構(gòu)成的，在紫外光激發(fā)下能發(fā)射出強烈綠色熒光的蛋白。在細胞和分子生物學(xué)中，綠色熒光蛋白通?？梢酝ㄟ^分子克隆手段與其它分子在體內(nèi)體外融合構(gòu)建生物傳感器。與一般在體內(nèi)具有毒性的熒光小分子不同（如FITC），熒光蛋白對細胞的毒性較小，有很

2、好的生物相容性。這個優(yōu)勢促使了綠色熒光蛋白在生物檢測方面的應(yīng)用發(fā)展，如活體內(nèi)熒光成像，DNA/RNA標記，或研究體內(nèi)外蛋白間的相互作用等。但目前熒光蛋白在蛋白酶和蛋白激酶活性檢測方面的應(yīng)用較少，所以急需開發(fā)熒光蛋白在該方面的檢測方法。
　　 本論文利用重組加強型綠色熒光蛋白(enhanced fluorescence protein，EGFP)和基于熒光蛋白的自組裝雙分子熒光互補對(self-assembling Bimolec

3、ularFluorescence Complementation，self-assembling BiFC)，開發(fā)了兩種無標記蛋白酶和蛋白激酶的熒光檢測方法。
　　 1、結(jié)合EGFP的自發(fā)熒光特性和鎳離子-氮三乙酸修飾的磁納米顆粒(Ni2+-NTAMNPs)的磁富集特性，開發(fā)了一種無標記、簡單的凝血酶熒光檢測方法。N端帶有組氨酸標簽(His-tag)和凝血酶識別位點的綠色熒光蛋白通過His tag-Ni2+-NTA之間的螯合作用

4、結(jié)合在Ni2+-NTA MNPs的表面，并在外界磁場存在下被Ni2+-NTAMNPs分離出上清液。當凝血酶存在時，位于N端His-tag和EGFP序列間的凝血酶識別多肽被特異性切割，使EGFP與His-tag分離，不會被吸附到Ni2+-NTA MNPs表面，從而EGFP在外界磁場存在下仍然留在上清液中，使上清液熒光強度保持在較高水平。因此，該體系中上清液熒光的改變可以反應(yīng)體系中凝血酶的含量。在優(yōu)化后的實驗條件下，該方法對凝血酶有較低的檢

5、測限(3.0×10-4 U mL-1)，并用此方法檢測了凝血酶的抑制劑水蛭素(Hirudin)，也在人血清實際樣品中通過標準添加的方法成功檢測了凝血酶活性。同時Ni2+-NTA MNPs的可重復(fù)利用性也說明這是一種簡單、靈敏、經(jīng)濟的凝血酶活性檢測方法，并有望于應(yīng)用在抗凝藥物的篩選中。
　　 2、通過酶切完整表達的綠色熒光蛋白，我們獲得了去除第十β片段(S10)后具有成熟發(fā)光基團的綠色熒光蛋白大片段(truncated GFP)。

6、在用胰蛋白酶酶切完整綠色熒光蛋白后，分別使用鹽酸胍、SDS、尿素變性分離truncated GFP和S10，評估這三種變性劑的變性及隨后的分離效果，以及得到的大片段truncated GFP與合成的S10片段混合后的熒光恢復(fù)情況。
　　 3、基于第2個工作中構(gòu)建的自組裝雙分子熒光互補對truncated GFP和S10，并用多肽合成方法在S10的C端融合cAMP依賴蛋白激酶(cAMP-dependent proteinkinas