熒光蛋白標(biāo)記檢測(cè)細(xì)胞自噬的方法改進(jìn).pdf

1、在酵母細(xì)胞自噬研究中，最常用的檢測(cè)細(xì)胞自噬的方法之一是用熒光蛋白標(biāo)記自噬相關(guān)蛋白。在我們的實(shí)驗(yàn)研究中，會(huì)經(jīng)常用到帶有熒光蛋白標(biāo)簽的融合蛋白。具體構(gòu)建方法是在PCR引物中加上45bp左右的目的基因同源片段，然后用擴(kuò)增的PCR片段轉(zhuǎn)化酵母，通過(guò)酵母細(xì)胞的同源重組在目的蛋白的C端連接上熒光蛋白。在大量的實(shí)驗(yàn)研究中，我們發(fā)現(xiàn)這種構(gòu)建融合蛋白的方法是相當(dāng)?shù)托У?。酵母?xì)胞中基因同源重組的正確率，在很大程度上取決于兩個(gè)基因同源片段的長(zhǎng)度。由于PCR引

2、物長(zhǎng)度的限制，這個(gè)加在PCR引物上的同源片段的長(zhǎng)度也是有限的，另外PCR過(guò)程中也會(huì)存在一定概率的突變。為了提高我們的實(shí)驗(yàn)效率同時(shí)降低試驗(yàn)誤差，我們構(gòu)建了兩組質(zhì)粒，用于快速的構(gòu)建自噬相關(guān)蛋白和GFP的融合蛋白。這些質(zhì)粒的構(gòu)建原則仍然是利用酵母基因同源重組，但是擴(kuò)大了同源片段的長(zhǎng)度，這樣融合蛋白菌株的構(gòu)建正確率從原來(lái)的10％左右提高到了現(xiàn)在的80％以上。并且構(gòu)建過(guò)程中不再需要PCR，這兩組質(zhì)粒在很大程度上提高了我們的實(shí)驗(yàn)效率和實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。

3、
　　細(xì)胞自噬被誘導(dǎo)之后，Atg8通過(guò)與脂類(lèi)分子PE結(jié)合，錨定在自噬體膜上。另外有研究指出，Atg8在介導(dǎo)膜延伸的過(guò)程中起作用，因此Atg8可以作為標(biāo)記來(lái)追蹤細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)以及細(xì)胞自噬的發(fā)展過(guò)程。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要研究者們構(gòu)建了GFP-Atg8和RFP-Atg8、cherry-Atg8、tomato-Atg8、dsred-Atg8等融合蛋白用來(lái)標(biāo)記PAS，GFP-Atg8在信號(hào)強(qiáng)度和蛋白功能上都是比較理想的。但是這些紅色熒光蛋白標(biāo)記的

4、Atg8融合蛋白信號(hào)很弱，并且融合蛋白的功能也很差，我們希望找到更好的紅色熒光蛋白用來(lái)標(biāo)記Atg8。
　　本論文致力于構(gòu)建2*dsred和4*dsred以及通過(guò)換用不同的連接多肽和啟動(dòng)子希望能在信號(hào)強(qiáng)度上和蛋白功能上能夠改造出更好的紅色熒光蛋白標(biāo)記的Atg8。到目前為止我們我們找到了一個(gè)在信號(hào)強(qiáng)度上有很大改進(jìn)并且蛋白功能有所提高的4*dsred-Atg8，結(jié)合我們所構(gòu)建的兩組其他自噬相關(guān)蛋白的GFP融合蛋白的質(zhì)粒，我們可以很方便的