長(zhǎng)非編碼反義RNA介導(dǎo)DHRS4基因調(diào)控的機(jī)制研究.pdf

1、長(zhǎng)非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是指一類含有200個(gè)核苷酸以上，但不能編碼蛋白質(zhì)的RNA分子。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA普遍存在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，通過(guò)表觀遺傳學(xué)調(diào)控、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)以及影響細(xì)胞核亞結(jié)構(gòu)的形成等多種方式參與眾多細(xì)胞生理功能的調(diào)節(jié)。lncRNA來(lái)源廣泛，它們可以轉(zhuǎn)錄自基因間區(qū)域、基因的上游區(qū)域、基因內(nèi)區(qū)域或與蛋白編碼基因形成自然反義轉(zhuǎn)錄本。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前發(fā)現(xiàn)人類約有10,000-15,000種

2、lncRNA，而僅有大約100種lncRNA的功能得到驗(yàn)證，還有大量lncRNA的功能尚待進(jìn)一步探究。
　　輔酶Ⅱ依賴性視黃醛脫氫還原酶（NADP(H)-dependent retinol dehydrogenase/reductase， NRDR）是全反式維甲酸合成代謝的關(guān)鍵酶，由DHRS4基因編碼。人DHRS4基因及其下游兩個(gè)同源基因DHRS4L2和DHRS4L1共同組成DHRS4基因簇，三者串聯(lián)排列于人類染色體14q11.2

3、位點(diǎn)。另外，在DHRS4基因反義鏈存在DHRS4-AS1（C14orf167）基因，其轉(zhuǎn)錄生成的lncRNA與DHRS4基因以頭對(duì)頭方式形成自然反義轉(zhuǎn)錄本（natural antisense transcripts，NATs），并對(duì)DHRS4基因簇的表達(dá)具有調(diào)控作用。
　　運(yùn)用RACE技術(shù)，我們?cè)谌瞬G丸細(xì)胞株和人正常肝細(xì)胞株HL7702中，分別克隆得到了序列完全相同的DHRS4-AS1轉(zhuǎn)錄本亞型——ASDHRS4-1。在人睪丸細(xì)胞

4、株中，利用siRNA干擾沉默ASDHRS4-1后，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)DHRS4 mRNA水平?jīng)]有變化，但運(yùn)用western blotting技術(shù)檢測(cè) NRDR蛋白水平下降，提示自然反義轉(zhuǎn)錄本ASDHRS4-1在翻譯水平調(diào)控DHRS4基因表達(dá)。為進(jìn)一步研究ASDHRS4-1對(duì)DHRS4基因調(diào)控的分子機(jī)制，我們對(duì)ASDHRS4-1進(jìn)行序列分析后發(fā)現(xiàn)，其序列中存在反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 LTR7C和AluSq以及與DHRS4基因的重疊區(qū)域——OL（

5、Overlap）序列。針對(duì)以上發(fā)現(xiàn)我們構(gòu)建了一系列由 LTR7C、AluSq和OL序列特定組合的反義質(zhì)粒，檢測(cè)不同反義序列對(duì)DHRS4表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在HL7702細(xì)胞株中，轉(zhuǎn)染ASDHRS4-1全長(zhǎng)質(zhì)粒后，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示DHRS4 mRNA水平同樣沒(méi)有變化，但western blotting結(jié)果顯示NRDR蛋白水平下降，而轉(zhuǎn)染其他質(zhì)粒蛋白質(zhì)和mRNA水平均無(wú)明顯變化。
　　基于以上的研究發(fā)現(xiàn)，我們認(rèn)為：1、ASDH