與小型非編碼RNA相關的血吸蟲基因操作技術研究.pdf

1、血吸蟲屬于扁形動物門裂體吸蟲綱，感染后所引起的血吸蟲病是僅次于瘧疾的世界第二大寄生蟲疾病。血吸蟲病的急性癥狀包括尾蚴皮炎和一系列超敏反應，而慢性血吸蟲感染往往造成泌尿系統(tǒng)或肝腸部位的病理損傷。目前，針對三種主要血吸蟲病病原（曼氏血吸蟲、日本血吸蟲和埃及血吸蟲）的基因組、轉錄組學研究已經取得了一定進展，下一步的工作將是針對那些組學揭示的蛋白編碼基因或具有調控功能的小RNA基因進行功能研究。
　　RNA干擾（RNAi）是一類發(fā)生于真核

2、細胞或病毒中的由雙鏈RNA誘導產生的基因沉默現象，siRNA與miRNA代表了兩種主要的RNAi誘發(fā)因子。siRNA通常作為一種反向遺傳學工具被用于蛋白編碼基因的功能研究，miRNA則是一種內源的基因表達調控分子，在不同生物體中具有重要的生理功能。本研究將圍繞siRNA和miRNA這兩種小型非編碼RNA分子，探索相關的血吸蟲基因操作技術。
　　首先，我們將外源siRNA引發(fā)的RNAi作為一種技術工具來進行日本血吸蟲醛糖還原酶(Sj

3、AR)基因的功能研究。針對SjAR基因的前期基礎性研究推測其可能參與了蟲體的抗宿主氧化機制，同時證實了基于SjAR蛋白三維結構設計出的候選藥物具有良好的殺蟲效果。本研究首先設計并合成了兩條針對SjAR轉錄本不同位置的siRNA，嘗試使用電轉和浸泡兩種手段向感染后14天的日本血吸蟲童蟲中轉化siRNA分子。在完成了蟲體RNA抽提、反轉錄等步驟后，用熒光定量PCR檢測SjAR基因轉錄本的表達水平。結果顯示，浸泡法實施的RNAi成功地降低了S

4、jAR在轉錄水平上的表達，siRNA處理組的SjAR轉錄本水平顯著地低于對照組。然而，電轉法實施的RNAi并未取得理想的效果，siRNA處理組與對照組的SjAR轉錄本水平并沒有顯著性差異。此后，我們使用Western雜交的方法檢測了浸泡法處理對于SjAR蛋白表達水平的影響，結果顯示siRNA處理組蟲體的SjAR蛋白含量確實低于對照組。對SjAR基因表達水平降低的蟲體進行顯微觀察并未發(fā)現明顯的表型變化。
　　此外，我們對血吸蟲內源m

5、iRNA調控功能開展了研究。為了驗證血吸蟲miRNA與靶信使RNA（mRNA）的互作關系，我們開發(fā)了針對血吸蟲的miRNA海綿技術平臺。熒光蛋白和熒光素酶作為兩種報告基因被用于了miRNA海綿轉錄本表達效果的驗證;而電轉被當做轉化方法以實現外源基因在血吸蟲細胞中的表達。針對GFP、Cherry兩種熒光蛋白質粒DNA的電轉轉化操作并不能誘發(fā)明顯的蟲體發(fā)光現象，且蟲體本身就具有的自發(fā)熒光現象影響了熒光蛋白做為報告基因在血吸蟲領域的應用。然而

6、，隨后對于熒光素酶mRNA或質粒DNA的電轉轉化操作獲得了良好的結果，蟲體表達的熒光素酶能夠高效地催化底物發(fā)光。不僅如此，當在熒光素酶編碼序列的下游引入串聯重復的血吸蟲miR-71結合單位后，蟲體表達的熒光素酶活力顯著下降。以上結果證明了應用以熒光素酶為報告基因的miRNA海綿進行血吸蟲miRNA調控功能研究的可行性。
　　隨后，我們對日本血吸蟲miR-71的作用靶基因進行了預測，共得出了5個可能被miR-71調控的日本血吸蟲基因