嗜熱酶高效表達(dá)及基于序列統(tǒng)計(jì)分析的酶pH適應(yīng)性研究.pdf

1、嗜熱酶具有高催化活性、良好熱穩(wěn)定性及有機(jī)溶劑抗逆性，在工業(yè)生產(chǎn)中有著極大應(yīng)用前景。但是，嗜熱酶高效表達(dá)策略的不完善導(dǎo)致其表達(dá)量低，極端酸堿環(huán)境也造成酶分子催化效率降低，甚至完全喪失活力，極大地制約了嗜熱酶的廣泛應(yīng)用。選擇合適的異源表達(dá)宿主，探索最優(yōu)化的表達(dá)策略，實(shí)現(xiàn)嗜熱酶的大規(guī)模異源高效表達(dá)，有助于降低酶制劑生產(chǎn)成本，推動(dòng)嗜熱酶產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程；同時(shí)，發(fā)展改造酶最適pH的有效策略，擴(kuò)展酶在極端酸堿條件下的催化能力，探索影響酶最適pH值的機(jī)制，

2、有望突破酶自然進(jìn)化的局限，具有重要意義。本論文對(duì)嗜熱酯酶以及嗜熱木聚糖酶進(jìn)行了異源高效表達(dá)，并進(jìn)行了基于酶家族序列統(tǒng)計(jì)分析的酶pH適應(yīng)性研究。
　　為探索嗜熱酶的異源高效表達(dá)策略，首先我們對(duì)目前報(bào)道活性最高的Alicyclobacillus acidocaldarius高溫酯酶EST2進(jìn)行了研究，在大腸桿菌以及畢赤酵母中分別建立了其高效表達(dá)系統(tǒng)并進(jìn)行了高密度發(fā)酵。將 EST2基因構(gòu)建到pET28a(+)和pPIC9K質(zhì)粒中，分別轉(zhuǎn)

3、化BL21(DE3)-codon plus(RIL)和GS115菌株；酶學(xué)性質(zhì)表征表明，不同宿主表達(dá)的重組EST2性質(zhì)基本一致；但高密度發(fā)酵表明大腸桿菌中的表達(dá)量（13700 U/mL）遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于畢赤酵母（960 U/mL）；對(duì)大腸桿菌系統(tǒng)的誘導(dǎo)溫度以及誘導(dǎo)起始細(xì)胞密度進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)溫度（25-37℃）對(duì)表達(dá)量影響不大；但開(kāi)始誘導(dǎo)時(shí)間有很大影響，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期表達(dá)量明顯高于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期，最佳誘導(dǎo)條件為：OD600=120時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)表達(dá)

4、，IPTG為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)12 h；最終OD600達(dá)到172，菌體干重為60.8 g/L，酶活力達(dá)到14800 U/mL，酶表達(dá)量為3.2 g/L，基本達(dá)到產(chǎn)業(yè)化水平。其次，我們對(duì)來(lái)源于Caldicellulosiruptor bescii DSM6725的嗜熱木聚糖酶CbX-CD進(jìn)行了異源高效表達(dá)研究，同樣構(gòu)建了其大腸桿菌以及畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌表達(dá)的CbX-CD具有更高的比活力，重組酶的最適 pH值向堿性偏移0.5個(gè)單位，且搖瓶

5、發(fā)酵表達(dá)量是畢赤酵母的13倍；進(jìn)一步對(duì)大腸桿菌高密度發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)OD600為90時(shí)加入 IPTG，誘導(dǎo)12 h后，細(xì)胞干重達(dá)到70 g/L，活力為45000 U/mL，單位時(shí)間產(chǎn)率為2140 U/mL/h,處于文獻(xiàn)報(bào)道領(lǐng)先水平。
　　酶催化的pH條件是酶發(fā)揮催化活性的重要影響因素，酶的最適 pH值受到蛋白質(zhì)微環(huán)境以及氨基酸相互作用的多重影響，傳統(tǒng)基于結(jié)構(gòu)的理性設(shè)計(jì)無(wú)法準(zhǔn)確選取影響酶最適pH值的潛在位點(diǎn)，探索高效的酶最適pH

6、值改造策略具有重要意義。GH11家族木聚糖酶最適pH值范圍分布較寬，是進(jìn)行酶pH適應(yīng)性研究的良好模式系統(tǒng)，我們構(gòu)建了該家族的序列及最適pH值數(shù)據(jù)庫(kù)，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析，探索高效定位影響酶最適pH值潛在位點(diǎn)的新方法。通過(guò)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)、一致性分析以及功能分析，我們從一千多條序列中選取115條，構(gòu)建了目前最完善的GH11家族木聚糖酶序列及最適pH值數(shù)據(jù)庫(kù)；利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)以及Lasso線性回歸進(jìn)行分析，獲得了8個(gè)影響酶最適pH值的潛在位點(diǎn)；

7、將這些位點(diǎn)引入木聚糖酶CbX-CD后發(fā)現(xiàn)，8個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)均對(duì)酶最適pH值有一定程度的影響，其中，F(xiàn)54W，S55D，A165E，D175Y以及Q176E突變體的最適pH值相比野生型向酸性發(fā)生0.5-0.75個(gè)單位的明顯偏移，且均保持野生型80％以上的活力；結(jié)構(gòu)模型分析表明：在遠(yuǎn)離催化殘基的位置（>10?），引入的可電離殘基（如突變體D175Y，S55D，A165E以及Q176E）與催化殘基Glu92及其周邊的高pKa值氨基酸（Arg49、