姜黃素通過調(diào)節(jié)小凹蛋白1對糖尿病腎病足細(xì)胞的保護作用.pdf

1、目的：
　　糖尿病大鼠腎臟中cav-1或p-cav-1的改變可激活TLR4,引發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)，而姜黃素治療可以通過抑制cav-1或p-cav-1與TLR4的相互作用，抑制由糖尿病引發(fā)的炎癥反應(yīng);姜黃素通過調(diào)節(jié)cav-1與β-catenin的交叉對話抑制糖尿病條件下足細(xì)胞的EMT，從而抑制腎臟纖維化進展。為驗證我們的假設(shè)，我們將首先檢測糖尿病大鼠腎臟中的炎癥因子、EMT、cav-1或p-cav-1的變化、TLR4以及β-cate

2、nin的變化，驗證其在體內(nèi)存在上述改變，然后利用體外高糖刺激的足細(xì)胞模型尋找上述指標(biāo)變化的機制。
　　方法：
　　為明確姜黃素對糖尿病大鼠腎組織中炎癥反應(yīng)的抑制作用及其機制，體內(nèi)實驗采用鏈脲佐菌素(STZ)一次性腹腔內(nèi)注射使糖尿病(diabetesmellitus，DM)大鼠成模，STZ注射后給予姜黃素100mg·kg-1·d-1灌胃。治療12周后，稱重、抽血、留尿、取腎，進而檢測各個指標(biāo)。體外實驗小鼠永生化足細(xì)胞系給予姜黃

3、素(1,5,10μM)預(yù)刺激1h后，給予高糖刺激72h。實驗室方法檢測大鼠空腹血糖、24h尿蛋白定量、腎重/體重和內(nèi)生肌酐清除率;PAS、masson染色以及FN、CollagenⅠ的免疫組織化學(xué)染色評估大鼠腎小球纖維化情況;采用免疫組織化學(xué)染色檢測大鼠腎臟中ED-1、MCP-1、TLR4的表達;用ELISA法檢測腎組織和足細(xì)胞中IL-6、TNFα的蛋白表達水平;實時熒光定量RT-PCR檢測腎臟和足細(xì)胞中IL-6、TNFα、IL-1β和

4、TLR4的基因表達水平;western blot方法檢測大鼠腎臟組織和足細(xì)胞中p-cav-1、cav-1、TLR4的蛋白表達。為了驗證TLR4與炎癥因子之間的關(guān)系，我們引進TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染進足細(xì)胞，實時熒光定量RT-PCR和ELISA法分別檢測高糖刺激的足細(xì)胞中IL-6、TNFα的表達水平。為了進一步研究p-cav-1的作用，我們引進cav-1 Tyr14磷酸化位點突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進足細(xì)胞，western blot方法檢測足細(xì)胞中

5、p-cav-1、cav-1、TLR4的表達，并用ELISA法檢測足細(xì)胞中IL-6、TNFα的蛋白表達水平。
　　為明確姜黃素對糖尿病大鼠腎臟足細(xì)胞EMT的作用和機制研究，體內(nèi)實驗采用STZ一次性腹腔注射使糖尿病大鼠成模，STZ注射后給予姜黃素100mg·kg-1·d-1灌胃。治療12周后，稱重、抽血、留尿、取腎，進而檢測各個指標(biāo)。體外實驗小鼠永生化足細(xì)胞系給予姜黃素（1,5,10μM）預(yù)刺激1h后，給予高糖刺激72h。實驗室方法檢

6、測大鼠空腹血糖、24h尿蛋白定量、腎重/體重和內(nèi)生肌酐清除率;PAS、masson染色方法評估大鼠腎小球的纖維化情況;電鏡檢測足細(xì)胞足突的融合情況;western blot、免疫組織化學(xué)染色和實時熒光定量RT-PCR方法檢測大鼠腎臟組織或足細(xì)胞中FSP-1、α-SMA、P-cadherin、synaptopodin的蛋白和基因表達;western blot、免疫組織化學(xué)染色方法檢測大鼠腎臟組織或足細(xì)胞中p-cav-1、cav-1、act

7、iveβ-catenin、β-catenin的表達。采用免疫共沉淀方法檢測cav-1與β-catenin之間相互作用;采用免疫熒光技術(shù)檢測cav-1與β-catenin之間的定位改變。
　　結(jié)果：
　　1.姜黃素通過抑制p-cav-1誘導(dǎo)的TLR4激活而抑制糖尿病大鼠腎臟的炎癥反應(yīng)。
　　2.姜黃素通過調(diào)控cav-1改善糖尿病大鼠腎臟足細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。
　　結(jié)論：
　　1.姜黃素預(yù)處理可以減輕STZ誘導(dǎo)

8、的糖尿病大鼠腎臟病理損傷，保護足細(xì)胞，減少尿蛋白，改善腎功能，延緩DN的進展。
　　2.姜黃素可改善STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟和高糖刺激的足細(xì)胞中炎癥反應(yīng)和EMT改變，減少糖尿病大鼠腎臟中巨噬細(xì)胞的浸潤及腎小球的纖維化。
　　3.姜黃素改善STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟和高糖刺激的足細(xì)胞中炎癥反應(yīng)的作用與抑制TLR4的激活有關(guān)。高糖可誘導(dǎo)足細(xì)胞中cav-1的磷酸化及TLR4的表達增加。姜黃素可能通過抑制p-cav-1誘導(dǎo)的TLR