長鏈非編碼RNA MEG3作用蛋白篩選與鑒定以及CDK3真核系列表達載體的構建.pdf

1、第一部分
　　目的：建立一種體內研究RNA-蛋白相互作用的新方法，篩選鑒定lncRNA MEG3相互作用蛋白。方法：利用噬菌體MS2衣殼蛋白可與MS2bs RNA特異性結合的特點，設計特異性引物，構建pcDNA3.0-Flag-2×MS2和pcDNA3.0-12×MS2bs表達載體，以及表達非編碼RNA MEG3的表達載體pcDNA3.0-MEG3V1-12×MS2bs；共轉染細胞，進行RNA免疫沉淀，所得RNA進行實時定量PCR

2、分析驗證；所得蛋白進行蛋白質譜分析和Western blot驗證。結果：成功構建了 pcDNA3.0-Flag-2× MS2、 pcDNA3.0-12× MS2bs和pcDNA3.0-MEG3V1-12×MS2bs表達載體。實時定量PCR結果表明，與對照相比，RNA免疫沉淀能明顯富集MEG3V1非編碼RNA分子；蛋白質譜和Western blot結果表明，與對照相比，RNA免疫沉淀能明顯富集MEG3V1相互作用蛋白。結論：成功構建了一種

3、體內研究RNA-蛋白質相互作用的表達載體，建立了一種體內研究RNA-蛋白質相互作用的新方法，為RNA-蛋白相互作用研究提供了新的技術手段，成功篩選出了MEG3V1的兩個相互作用蛋白，ILF3和PABPC3。
　　第二部分
　　目的：構建系列細胞周期蛋白依賴激酶3（CDK3）在哺乳動物細胞的表達載體，并在真核細胞中進行初步的表達。方法：從食管癌細胞中提取總RNA，逆轉錄PCR擴增CDK3編碼區(qū)，然后將PCR產物克隆到T載體；擴

4、增后的CDK3片段分別克隆入pcDNA3、pcDNA4、pNTAP和pEGFP等四種哺乳動物表達載體；最后，將獲得的表達載體轉染小鼠成纖維細胞NIH3T3進行初步的CDK3表達分析。結果：PCR擴增獲得約900bp的目的片段，經T載體克隆和DNA序列分析顯示重組片段是人CDK3基因序列，全長915bp；CDK3片段分別克隆入pcDNA3、pcDNA4、pNTAP和pEGFP載體，獲得相應表達載體；構建的表達載體可以在真核細胞中表達出CD