長鏈非編碼RNA MEG3作用蛋白篩選與鑒定以及CDK3真核系列表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、第一部分
　　目的：建立一種體內(nèi)研究RNA-蛋白相互作用的新方法，篩選鑒定lncRNA MEG3相互作用蛋白。方法：利用噬菌體MS2衣殼蛋白可與MS2bs RNA特異性結(jié)合的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性引物，構(gòu)建pcDNA3.0-Flag-2×MS2和pcDNA3.0-12×MS2bs表達(dá)載體，以及表達(dá)非編碼RNA MEG3的表達(dá)載體pcDNA3.0-MEG3V1-12×MS2bs；共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，進(jìn)行RNA免疫沉淀，所得RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR

2、分析驗(yàn)證；所得蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析和Western blot驗(yàn)證。結(jié)果：成功構(gòu)建了 pcDNA3.0-Flag-2× MS2、 pcDNA3.0-12× MS2bs和pcDNA3.0-MEG3V1-12×MS2bs表達(dá)載體。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，與對照相比，RNA免疫沉淀能明顯富集MEG3V1非編碼RNA分子；蛋白質(zhì)譜和Western blot結(jié)果表明，與對照相比，RNA免疫沉淀能明顯富集MEG3V1相互作用蛋白。結(jié)論：成功構(gòu)建了一種

3、體內(nèi)研究RNA-蛋白質(zhì)相互作用的表達(dá)載體，建立了一種體內(nèi)研究RNA-蛋白質(zhì)相互作用的新方法，為RNA-蛋白相互作用研究提供了新的技術(shù)手段，成功篩選出了MEG3V1的兩個(gè)相互作用蛋白，ILF3和PABPC3。
　　第二部分
　　目的：構(gòu)建系列細(xì)胞周期蛋白依賴激酶3（CDK3）在哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)載體，并在真核細(xì)胞中進(jìn)行初步的表達(dá)。方法：從食管癌細(xì)胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增CDK3編碼區(qū)，然后將PCR產(chǎn)物克隆到T載體；擴(kuò)

4、增后的CDK3片段分別克隆入pcDNA3、pcDNA4、pNTAP和pEGFP等四種哺乳動物表達(dá)載體；最后，將獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3進(jìn)行初步的CDK3表達(dá)分析。結(jié)果：PCR擴(kuò)增獲得約900bp的目的片段，經(jīng)T載體克隆和DNA序列分析顯示重組片段是人CDK3基因序列，全長915bp；CDK3片段分別克隆入pcDNA3、pcDNA4、pNTAP和pEGFP載體，獲得相應(yīng)表達(dá)載體；構(gòu)建的表達(dá)載體可以在真核細(xì)胞中表達(dá)出CD