PCBP2基因座位上長非編碼RNA的篩選與鑒定.pdf

1、長非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一類長度大于200 nt，以RNA形式發(fā)揮作用的轉錄產(chǎn)物。根據(jù)lncRNA與蛋白編碼基因的相對位置，可分為:正義(sense)、反義(antisense)、雙向(bidirectional)、內(nèi)含子(intronic)、基因間(intergenic)五類。H Y.Chang等人近期總結了基因組范圍內(nèi)篩選lncRNAs的一般策略，即通過將基因組片段上組蛋白修飾活性數(shù)據(jù)與

2、RNA-seq數(shù)據(jù)相結合分析，尋找潛在的基因間lncRNAs;進而對lncRNAs的編碼能力進行分析，確定它們的非編碼性質(zhì)。上述方法對尋找基因間lncRNAs比較有效，但對于編碼基因內(nèi)部與基因同向的正義lncRNAs和內(nèi)含子lncRNAs的篩選卻存在一定的局限性。
　　 選擇性剪接(Alternative Splicing)是產(chǎn)生蛋白質(zhì)功能多樣性的重要途徑之一。以往研究更多關注編碼基因剪接多樣性，也有相關研究報道lncRNAs也

3、存在選擇性剪接。RNA結合蛋白PCBP2在小鼠和人中均存在由選擇性剪接產(chǎn)生的多種轉錄本形式，且在不同的生物學過程中發(fā)揮作用。研究報道該基因9號外顯子位置有可轉錄lncRNA的存在，即T-UC.338，其在肝癌中發(fā)揮重要的生物學功能，但該區(qū)域是否僅存在T-UC.338一個非編碼RNA轉錄物尚不可知。
　　 本研究即以PCBP2內(nèi)部的9號外顯子區(qū)域為研究對象，探討在該區(qū)域發(fā)現(xiàn)潛在lncRNAs的生物信息學分析方法，以及該區(qū)域內(nèi)lnc

4、RNAs發(fā)生多重轉錄、剪接的可能。本研究從現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫(UCSC http://genome.ucsc.edu/)入手，選擇在同一基因座位(PCBP2的9號外顯子區(qū)，UC.338基因座位)上，由內(nèi)含子區(qū)域轉錄、剪接形成的ESTs進行鑒定和分析，并根據(jù)同源性分析結果在人和小鼠中分別進行篩選，得到四個ESTs:人源ESTs HY121526和DB276896，鼠源ESTs BQ917950和BF150035。利用Coding Potenti

5、al Calculater(CPC http://cpc.cbi.pku.edu.cn)進行蛋白質(zhì)編碼能力分析，并將CPC分析得分與同基因座位上的對應編碼基因(PCBP2)的CPC分值進行統(tǒng)計學比較，篩選潛在的lncRNAs。其中HY121526、BQ917950和BF150035均顯示非編碼RNA的性質(zhì)。同時本研究用PCR方法檢測這四個ESTs以及T-UC.338在不同組織中的表達譜和在同一組織中不同時間點的表達變化來排除其為轉錄噪音

6、的可能性，最終發(fā)現(xiàn)在人各細胞系中HY121526的表達具有一定的細胞特異性，沒有檢測到DB276896的表達，人源T-UC.338(H-T-UC.338)的表達也具有一定的細胞特異性;在小鼠各組織中BQ917950的表達不僅具有組織特異性，并且BQ917950在小鼠大腦發(fā)育不同時間點的表達隨時間的推移呈明顯下降趨勢，而BF150035在小鼠各組織中廣泛表達。鼠源T-UC.338(M-T-UC.338)的表達也具有組織特異性，在小鼠大腦發(fā)

7、育不同時間點的表達隨時間的推移呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。
　　 本研究用RACE和步移的方法驗證了H-T-UC.338的全長序列，發(fā)現(xiàn)H-T-UC.338的長度要超出文獻報道的590bp，并檢測了鼠源M-T-UC.338的全長。本研究分別做了探針，下一步將嘗試用Northern的方法驗證各lncRNAs的全長。根據(jù)相關報道，lncRNA很可能通過其所在基因座位上的編碼基因起作用，并具有一定的保守性，雖然H-T-UC.338在肝癌中