人eif4a3真核表達(dá)載體構(gòu)建及穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株篩選

1、<p>　　人eIF4A3真核表達(dá)載體構(gòu)建及穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株篩選</p><p>　　李向云1，2，徐祥2，李秉煦1，黃宏2，徐云升1*</p><p>　　溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院皮膚科，325000；2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院外科研究所一室，400002）</p><p>　　摘要：目的 構(gòu)建人eIF4A3重組質(zhì)粒載體,并篩選高表達(dá)人eIF4A3的穩(wěn)定細(xì)胞株

2、。方法 RT-PCR克隆eIF4A3基因，并將獲得的基因片段分別連接到含有HA和c-myc標(biāo)簽的質(zhì)粒載體上，轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，后經(jīng)G418篩選獲穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，同時(shí)在體外翻譯體系中進(jìn)行體外翻譯，并通過免疫印跡鑒定eIF4A3的表達(dá)。結(jié)果 成功構(gòu)建人eIF4A3的真核表達(dá)載體，可在Hela細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，且能在體外翻譯體系中翻譯eIF4A3蛋白質(zhì)。結(jié)論 獲得了可穩(wěn)定高表達(dá)人eIF4A3的Hela細(xì)胞株，以及可用于體外翻譯的真核表達(dá)載體。&

3、lt;/p><p>　　關(guān)鍵詞：真核起始因子4A3；穩(wěn)定細(xì)胞株；體外翻譯</p><p>　　中圖分類號(hào)：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：C</p><p>　　Construction of Eukaryotic Expression Plasmid and Establishment of Stable Cell Li

4、ne for Human eIF4A3 Expression</p><p>　　Li Xiangyun1,2, Xu Xiang2, Li Bingxu1, Huang Hong2, Xu Yunsheng1*</p><p>　　（1. Department of dermatology， The first Affiliated Hospital， Wenzhou Medical U

5、niversity， Wenzhou， 325000; 2. State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, Department 1, Research Institute of Surgery, Daping Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing， 400002, China）&

6、lt;/p><p>　　Abstract: Objective: Construct human eIF4A3 recombinant vector and select the stable cell line overexpressing eIF4A3. Methods: Human eIF4A3 was amplified by RT-PCR from Hela cells and subcloned into

7、 eukaryotic expression vectors containing HA and c-myc tag respectively. A stable cell line was generated by transfecting Hela cells and G418 selection. Meanwhile, in vitro translation was conducted and the expression of

8、 eIF4A3 was verified by Western blot. Results: We successfully constructed eukaryo</p><p>　　Key words: eukaryotic initiation factor 4A3; stable cell line; in vitro translation</p><p>　　蛋白質(zhì)翻譯起始是蛋

9、白質(zhì)合成的限速步驟。DEAD盒蛋白質(zhì)家族在翻譯起始中起重要作用。此家族含有9個(gè)保守的蛋白質(zhì)基序，其中基序Ⅱ的氨基酸排列D-E-A-D(Asp-Glu-Ala-Asp)為大部分家族成員所共有并因此取為家族名稱[1]。DEAD盒蛋白質(zhì)家族中的成員在功能上也有一定的相似性，如許多蛋白質(zhì)都具有RNA依賴的ATP水解酶活性和ATP依賴的RNA解旋酶活性[2]。</p><p>　　真核細(xì)胞翻譯起始因子4A（eukaryot

10、ic translation initiation factor 4A，eIF4A）是DEAD盒蛋白質(zhì)家族中的一員[3]，其所具有的RNA解旋酶活性可解旋mRNA 5’-非翻譯區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)[4]，促進(jìn)40S核糖體亞基對(duì)起始密碼子的掃描，從而在蛋白質(zhì)翻譯起始中起到非常重要的作用。eIF4A有三種異構(gòu)體，其中eIF4A1與eIF4A2在序列和功能上基本一致，而eIF4A3與eIF4A1在序列上只有65%的相似性[5]。另外eIF4A1和eI

11、F4A2主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，與真核細(xì)胞起始因子4E（eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E）和真核細(xì)胞起始因子4G（eukaryotic translation initiation factor 4G，eIF4G）共同組成真核細(xì)胞起始因子4F（eukaryotic translation initiation factor 4F，eIF4F）復(fù)合體，參與蛋白質(zhì)翻譯起始；而eI

12、F4A3主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，是外顯子連接復(fù)合體的一個(gè)組成成分[6]，參與mRN</p><p>　　目前關(guān)于eIF4A3在蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控中的作用尚未研究清楚，且存在自相矛盾的報(bào)道[5、7]。本團(tuán)隊(duì)致力于蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控機(jī)制的研究，為充分解析eIF4A3在蛋白質(zhì)翻譯中的作用及其生物學(xué)功能，本研究首先采用RT-PCR自人cDNA克隆獲得eIF4A3基因，后構(gòu)建可用于體外翻譯并帶有HA或c-myc標(biāo)簽以及篩選標(biāo)記的真核表

13、達(dá)載體，并篩選獲得高效穩(wěn)定表達(dá)外源性eIF4A3的細(xì)胞株，從而為進(jìn)一步深入研究eIF4A3的功能及其在蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控中的作用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。</p><p><b>　　材料和方法</b></p><p><b>　　質(zhì)粒與菌株 </b></p><p>　　pcDNA質(zhì)粒（含HA標(biāo)簽），pCMV-tag3C質(zhì)粒（含c-

14、myc標(biāo)簽），TOP10菌為本實(shí)驗(yàn)室保存。</p><p><b>　　細(xì)胞與主要試劑 </b></p><p>　　Hela細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保種。限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ、T4 DNA連接酶為Takara產(chǎn)品。TNT SP6/T7 Coupled Reticulocyte Lysate System購自Promega公司。HA、c-myc抗體為Takara產(chǎn)

15、品。</p><p>　　目的基因eIF4A3的克隆 </p><p>　　收集六孔板一個(gè)孔的Hela細(xì)胞，提取RNA后進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)（試劑盒購自北京白泰克生物技術(shù)有限公司），所用擴(kuò)增eIF4A3的兩條引物設(shè)計(jì)如下：上引物：5’-CGGGAATTCATGGCGGCTAACGCCACGATGGC-3’,下引物：5’-CGGCTCGAGTCAGATGAGGTCAGCCACATTC-3’

16、,取PCR產(chǎn)物與T載體連接（T-eIF4A3）備用。</p><p>　　重組質(zhì)粒pcDNA-HA-eIF4A3、pCMV-c-myc-eIF4A3的構(gòu)建和鑒定 </p><p>　　將pcDNA、pCMV-tag3C及上述T-eIF4A3分別用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收載體和目的基因后分別用T4 DNA連接酶連接，即為重組質(zhì)粒pcDNA-HA-eIF4A3、pCMV-c-myc-

17、eIF4A3，在進(jìn)行PCR和雙酶切初步鑒定后，進(jìn)一步測序鑒定。</p><p>　　純化質(zhì)粒大量抽提 </p><p>　　將構(gòu)建好的質(zhì)粒菌液擴(kuò)增200ml，并使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量制備試劑盒（購自北京白泰克生物技術(shù)有限公司）對(duì)以下四種質(zhì)粒進(jìn)行抽提，分別為：pcDNA（空白對(duì)照），pcDNA-HA-eIF4A3；pCMV（空白對(duì)照），pCMV-c-myc-eIF4A3，然后測定質(zhì)粒濃度。&

18、lt;/p><p>　　穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選與鑒定 </p><p>　　將pCMV-tag3C、pCMV-c-myc-eIF4A3分別轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞中，換液后加G418（濃度為500μg/ml）篩選兩周，挑取單克隆進(jìn)行擴(kuò)增保種，余以200μg/ml的G418維持培養(yǎng)。Western 免疫印跡檢測eIF4A3蛋白的表達(dá)，鑒定陽性細(xì)胞克隆。</p><p><b&

19、gt;　　體外翻譯實(shí)驗(yàn) </b></p><p>　　具體步驟為TNT Rabbit Reticulocyte Lysate 12.5μl,Amino Acids Minus Methionine 0.25μl, Amino Acids Minus Leucine 0.25μl, TNT Reaction Buffer 1μl, TNT T7 Polymerase 0.5μl, RNasin Rib

20、onuclease Inhibitor 0.5μl, recombinant plasmid(pCDNA-HA、pCDNA-HA- eIF4A3) 1.1μl, ddH2O 補(bǔ)至25μl,混勻后放入30℃水浴箱中孵育90min，則eIF4A3基因翻譯為eIF4A3蛋白，取2μl進(jìn)行后續(xù)的Western免疫印跡實(shí)驗(yàn)以檢測eIF4A3是否表達(dá)。</p><p>　　Western 免疫印跡檢測eIF4A3蛋白的表達(dá)

21、 </p><p>　　將所篩選的穩(wěn)定細(xì)胞系鋪6cm平板，不加G418培養(yǎng)至細(xì)胞密度為80%-90%，加200μl RIPA裂解液提取蛋白后用考馬斯亮藍(lán)G250定量，取50μg蛋白上樣。一抗孵c-myc（1：1000）4℃過夜，二抗羊抗鼠（1：15000）室溫2h，后加化學(xué)發(fā)光劑，壓片顯影。體外翻譯實(shí)驗(yàn)取2μl上樣，一抗孵HA（1：1000）4℃過夜，二抗羊抗鼠（1：15000）室溫2h，后加化學(xué)發(fā)光劑，壓片顯影

22、。</p><p>　　1.9檢測eIF4A3的高表達(dá)對(duì)蛋白質(zhì)翻譯的影響</p><p>　　將熒光素酶報(bào)告基因和pCMV-c-myc-eIF4A3真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，48小時(shí)后裂解細(xì)胞，加入熒光素酶底物（購自Promega公司），并測定化學(xué)發(fā)光值，作為評(píng)價(jià)熒光素酶翻譯水平的指標(biāo)。同時(shí)以熒光素酶報(bào)告基因和空載體pCMV共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞作為對(duì)照組實(shí)驗(yàn)。</p>&

23、lt;p><b>　　結(jié)果</b></p><p>　　2.1 目的基因eIF4A3的制備 </p><p>　　從Hela細(xì)胞中提取獲得細(xì)胞總RNA，其中即包括可翻譯為eIF4A3蛋白的RNA。以此為模板，應(yīng)用上述引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增獲得eIF4A3基因片段，結(jié)果見圖1，片段大小與eIF4A3基因相一致。</p><p>　　圖1

24、 通過RT-PCR制備的目的基因eIF4A3</p><p>　　2.2重組質(zhì)粒pcDNA-HA-eIF4A3、pCMV-c-myc-eIF4A3的酶切鑒定 </p><p>　　用EcoRⅠ和XhoⅠ這兩種酶對(duì)重組質(zhì)粒pcDNA-HA-eIF4A3、pCMV-c-myc-eIF4A3進(jìn)行雙酶切鑒定，理論上，這兩種質(zhì)粒的大小分別為6600bp和5500bp，經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切后可得到

25、兩條片段，約1236bp的小片段即為eIF4A3基因，用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析所得到的酶切片段與理論預(yù)測值相符（圖2，3），測序結(jié)果也證實(shí)構(gòu)建的eIF4A3表達(dá)載體序列和閱讀框均正確。</p><p>　　圖2 重組質(zhì)粒pcDNA-HA-eIF4A3的雙酶切鑒定</p><p>　　圖3 重組質(zhì)粒pCMV-c-myc-eIF4A3的雙酶切鑒定</p><p>

26、　　2.3穩(wěn)定細(xì)胞系中重組質(zhì)粒的表達(dá) </p><p>　　重組質(zhì)粒pCMV（空白對(duì)照），pCMV-c-myc-eIF4A3轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞中后，用G418篩選兩周可在鏡下觀察到細(xì)胞克隆，挑取單克隆擴(kuò)增后提取蛋白做Western免疫印跡，可看到對(duì)照組中無外源性eIF4A3表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組則有帶c-myc標(biāo)簽的eIF4A3（約47kDa）的表達(dá)，結(jié)果見圖4。</p><p>　　圖4 重組

27、質(zhì)粒在Hela細(xì)胞中的表達(dá)</p><p>　　2.4重組質(zhì)粒在體外翻譯中的表達(dá) </p><p>　　用體外翻譯試劑盒對(duì)重組質(zhì)粒在體外進(jìn)行翻譯，對(duì)照組無目的條帶出現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組則有帶HA標(biāo)簽的eIF4A3的表達(dá)（圖5）。</p><p>　　圖5 重組質(zhì)粒在體外翻譯中的表達(dá)</p><p>　　2.5 eIF4A3高表達(dá)對(duì)蛋白質(zhì)翻譯的影響&

28、lt;/p><p>　　將eIF4A3基因及其空載體分別與熒光素酶報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞中，瞬時(shí)表達(dá)熒光素酶，測定化學(xué)發(fā)光值，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組降低了約92%（圖6）。說明eIF4A3起抑制蛋白質(zhì)翻譯的作用。</p><p>　　圖6 eIF4A3的高表達(dá)對(duì)熒光素酶蛋白翻譯的影響</p><p><b>　　討論</b></p>

29、<p>　　蛋白質(zhì)翻譯起始是蛋白質(zhì)合成的限速步驟，這一過程涉及多種翻譯起始因子的參與。其中， eIF4A在蛋白質(zhì)翻譯起始中起到非常重要的作用，但是，其亞族e(cuò)IF4A3的生物學(xué)功能尚不清楚。</p><p>　　目前研究認(rèn)為，eIF4A3在蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控中起重要作用。eIF4A3為RNA依賴的ATP水解酶和ATP依賴的RNA解旋酶，其RNA解旋酶活性可解旋mRNA 5’-非翻譯區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)翻譯起

30、始復(fù)合物與mRNA的結(jié)合。但是，另有研究表明eIF4A3為外顯子連接復(fù)合體的一員，在此復(fù)合體中，eIF4A3以鉗夾的方式與RNA相結(jié)合[8]，并與其他三種蛋白質(zhì)MLN51、Y14及Magoh組成外顯子連接復(fù)合體的核心成分[9、10]，從而為其他數(shù)十種因子的結(jié)合提供一個(gè)平臺(tái)[11]。外顯子連接復(fù)合體除了促進(jìn)未成熟的mRNA剪接為成熟的無內(nèi)含子的mRNA外，還伴隨mRNA出核，在出核的過程中及隨后的翻譯中都起到調(diào)節(jié)作用，直到翻譯起始時(shí)核糖體

31、與mRNA結(jié)合后才可促發(fā)其從mRNA上解離下來[12]。在這整個(gè)過程中，外顯子連接復(fù)合體的許多成員都對(duì)翻譯起到促進(jìn)作用，其中eIF4A3促進(jìn)翻譯的作用是在80S核糖體亞基形成之后[13]。</p><p>　　本研究結(jié)果顯示，eIF4A3的過表達(dá)可顯著抑制熒光素酶報(bào)告基因的蛋白表達(dá)水平，初步說明eIF4A3對(duì)蛋白質(zhì)翻譯起抑制作用。Li, Q.等人et al研究也發(fā)現(xiàn)eIF4A3對(duì)翻譯有抑制作用，這與本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

32、相一致，這個(gè)結(jié)果與其同源物eIF4A1的作用相反[5]，可能是由于eIF4A1可與eIF4G的中間區(qū)域及氨基末端區(qū)域相結(jié)合，而eIF4A3只能與eIF4G的中間區(qū)域相結(jié)合[15、16、17]。而筆者認(rèn)為，eIF4A3可能與80S核糖體亞基處于一種動(dòng)態(tài)的結(jié)合過程，而eIF4A3的過表達(dá)，促進(jìn)其與80S核糖體牢固結(jié)合，可能抑制翻譯延伸或肽的釋放過程。也有學(xué)者認(rèn)為它可能在某些情況下對(duì)翻譯有促進(jìn)作用，在另一些情況下則表現(xiàn)為抑制作用，但具體機(jī)制尚

33、不明確。</p><p>　　本研究成功構(gòu)建人eIF4A3的真核表達(dá)載體，獲得了可穩(wěn)定高表達(dá)人eIF4A3的Hela細(xì)胞株，建立了人eIF4A3的體外翻譯系統(tǒng)。本研究的完成為進(jìn)一步揭示eIF4A3的結(jié)構(gòu)和功能，及其在蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控中的作用研究奠定基礎(chǔ)。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1] Imataka,

34、 H., H. S. Olsen, et al. A new translational regulator with homology to eukaryotic translation initiation factor 4G[J]. EMBO J, 1997, 16(4): 817–825</p><p>　　[2] Sonenberg, N. and T. E. Dever. Eukaryotic tra

35、nslation initiation factors and regulators[J]. Curr Opin Struct Biol, 2003, 13(1): 56-63</p><p>　　[3] Narendra Tuteja, Ajay Amar Vashisht and Renu Tuteja. Translation initiation factor 4A: a prototype member

36、 of dead-box protein family[J]. Physiol. Mol. Biol. Plants, 2008, 14(1&2): 101-107</p><p>　　[4] Rogers, G. W., Jr., W. F. Lima, et al. Further Characterization of the Helicase Activity of eIF4A. Substrat

37、e specificity[J]. J Biol Chem, 2001, 276(16): 12598-12608</p><p>　　[5] Li, Q., H. Imataka, et al. Eukaryotic Translation Initiation Factor 4AIII (eIF4AIII) Is Functionally Distinct from eIF4AI and eIF4AII[J]

38、. Mol Cell Biol, 1999, 19(11): 7336-7346</p><p>　　[6] Chan, C. C., J. Dostie, et al. eIF4A3 is a novel component of the exon junction complex[J]. RNA, 2004, 10(2):200-209</p><p>　　[7] Nott, A.,

39、H. Le Hir, et al. Splicing enhances translation in mammalian cells: an additional function of the exon junction complex[J]. Genes Dev., 2004, 18(2): 210-222</p><p>　　[8] Bono, F., J. Ebert, et al. The Crysta

40、l Structure of the Exon Junction Complex Reveals How It Maintains a Stable Grip on mRNA[J]. Cell, 2006, 126(4): 713–725</p><p>　　[9] Le Hir, H. and G. R. Andersen. Structural insights into the exon junction

41、complex[J]. Curr Opin Struct Biol, 2008, 18(1): 112–119</p><p>　　[10] Stroupe, M. E., T. O. Tange, et al. The Three-dimensional Arcitecture of the EJC Core[J]. J Mol Biol, 2006, 360(4): 743–749</p>&l

42、t;p>　　[11] Bercovich, N., M. J. Levin, et al. Identi?cation of core components of the exon junction complex in trypanosomes[J]. Mol Biochem Parasitol, 2009, 166(2): 190–193</p><p>　　[12] Ballut, L., B. Ma

43、rchadier, et al. The exon junction core complex is locked onto RNA by inhibition of eIF4AIII ATPase activity[J]. Nat Struct Mol Biol, 2005, 12(10): 861-869</p><p>　　[13] Lee, H. C., J. Choe, et al. Exon junc

44、tion complex enhances translation of spliced mRNAs at multiple steps[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2009, 384(3): 334–340</p><p>　　[14] Wilkinson, M. F. A new function for nonsense-mediated mRNA-decay facto

45、rs[J]. Trends Genet, 2005, 21(3): 143-148</p><p>　　[15] Korneeva, N. L., B. J. Lamphear, et al. Characterization of the Two eIF4A-binding Sites on Human eIF4G-1[J]. J Biol Chem, 2001, 276(4): 2872-2879</p

46、><p>　　[16] Schutz, P., M. Bumann, et al. Crystal structure of the yeast eIF4A-eIF4G complex: An RNA-helicase controlled by protein–protein interactions[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105(28): 9564-9569<