人成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化形成神經(jīng)元前體細(xì)胞的研究.pdf

1、神經(jīng)退行性疾病(Neurodegenerative disease)是大腦或脊髓的神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能喪失導(dǎo)致的神經(jīng)疾病，如:阿茲海默癥、帕金森病、亨廷頓舞蹈癥和脊髓側(cè)索硬化癥等，對(duì)人類(lèi)特別是老年人的健康構(gòu)成了巨大的威脅。人們?cè)噲D通過(guò)化學(xué)藥物治療這些疾病，但都沒(méi)有取得好的效果。于是，人們嘗試通過(guò)細(xì)胞移植治療的方法修復(fù)受損神經(jīng)元。到目前為止，已經(jīng)有多種細(xì)胞通過(guò)移植實(shí)驗(yàn)被證明對(duì)神經(jīng)修復(fù)具一定作用，如多能性干細(xì)胞(PSCs)、造血干細(xì)胞(HS

2、Cs)、間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)、神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)、限制性神經(jīng)元前體細(xì)胞(NRPs)、特定的神經(jīng)元(specialneurons)等。
　　由于多能性干細(xì)胞具有自我更新和分化為各種細(xì)胞類(lèi)型的能力，然而這類(lèi)細(xì)胞分化方向難以控制，直接注射到體內(nèi)易形成畸胎瘤，所以并不適合直接用于臨床治療。造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞是成體中存在的，并且研究得最深入的三類(lèi)成體干細(xì)胞。造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞在一定條件下可表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)基因

3、，因此臨床前研究常使用這兩類(lèi)干細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)退行性疾病的治療。然而，這兩類(lèi)干細(xì)胞在體內(nèi)轉(zhuǎn)分化成為神經(jīng)細(xì)胞的效率非常低，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療作用并不十分明顯。神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞(NPs)為多能(mutipotent)細(xì)胞，可以分化產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)兩類(lèi)主要的細(xì)胞:神經(jīng)元(neurons)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(glialcells)。但細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)更易分化成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，而不是形成功能性神經(jīng)元。所以NSCs的移植治療效果也不理

4、想。功能性神經(jīng)元理論上可以用于因特定神經(jīng)元損傷造成的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。但由于神經(jīng)元屬于終末分化細(xì)胞，不具有分裂增殖能力，難以獲得足夠用于治療的神經(jīng)元。并且，神經(jīng)細(xì)胞直接移植到大腦中，其成活率和整合率都比較低，從而限制了它臨床應(yīng)用的可操作性。
　　在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，存在另一個(gè)主要的細(xì)胞類(lèi)型，即限制性神經(jīng)元前體細(xì)胞(Neuronal restricted progenitors，NRPs)，簡(jiǎn)稱(chēng)神經(jīng)元前體細(xì)胞。它由神經(jīng)前體細(xì)胞進(jìn)一步分

5、化產(chǎn)生，具有一定自我更新能力和神經(jīng)元系(Neuronal lineage)分化能力，在成體大腦中有遷移能力，并進(jìn)一步特異地分化形成功能性神經(jīng)元。NRP細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)元的一個(gè)過(guò)渡中間體，相比于神經(jīng)干細(xì)胞，神經(jīng)元前體細(xì)胞的分化能力被進(jìn)一步限制，僅特異地分化為神經(jīng)元，而不會(huì)分化形成膠質(zhì)細(xì)胞。神經(jīng)元前體細(xì)胞被認(rèn)為在神經(jīng)系統(tǒng)的自我修復(fù)過(guò)程中起著重要作用，利用其進(jìn)行神經(jīng)退行性疾病的治療將更加安全有效。然而，從正常的神經(jīng)組織中獲取神經(jīng)元前體細(xì)

6、胞非常困難，從而阻止其在臨床進(jìn)一步應(yīng)用。因此我們希望通過(guò)轉(zhuǎn)分化技術(shù)將常見(jiàn)的成纖維細(xì)胞直接誘導(dǎo)為神經(jīng)元前體細(xì)胞，從而獲得大量的用于治療的細(xì)胞。
　　轉(zhuǎn)分化技術(shù)是指在體外培養(yǎng)條件下，通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法將一種成體細(xì)胞類(lèi)型直接誘導(dǎo)為另一種成體細(xì)胞類(lèi)型的技術(shù)。與體細(xì)胞重編程相比，轉(zhuǎn)分化技術(shù)從誘導(dǎo)到移植治療的過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，所需的時(shí)間較短，且成本較低。
　　在本課題中，我們從已知的在誘導(dǎo)神經(jīng)元和神經(jīng)干細(xì)胞過(guò)程中起著重要作用的基因中篩選出8個(gè)基

7、因:Sox2、c-Myc、Klf4、TLX、Bmi1、BRN2、hBRN4和hFoxG1，將它們分別包裝到慢病毒顆粒中，并將這些慢病毒混合在一起，感染人胎兒成纖維細(xì)胞。經(jīng)過(guò)11-12天的誘導(dǎo)后，成纖維細(xì)胞增殖并形成緊實(shí)的細(xì)胞集落。通過(guò)不同因子組合誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)這8個(gè)基因中，只需要3個(gè)因子Sox2，c-Myc加上hBRN2或hBRN4的一種，就足以誘導(dǎo)獲得大量細(xì)胞集落。在低氧條件下，僅需7天就可以形成細(xì)胞集落。這些細(xì)胞體積小，增殖快，

8、并且一些細(xì)胞克隆在鋪有Matrigel的培養(yǎng)皿中可以穩(wěn)定培養(yǎng)30代以上。經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記Nestin被大量激活。在無(wú)血清神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，細(xì)胞分化形成神經(jīng)元的形態(tài)，并表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記基因Tuj1。而在含血清的膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，細(xì)胞并不形成GFAP陽(yáng)性的膠質(zhì)細(xì)胞。由此我們猜測(cè)這些細(xì)胞為為神經(jīng)樣特異性前體細(xì)胞(hiNRPs)，而不是神經(jīng)干細(xì)胞。為進(jìn)一步證實(shí)這種假設(shè)，我們通過(guò)全基因表達(dá)分析證明這類(lèi)細(xì)胞的基因表達(dá)模式已經(jīng)完全不同于成纖

9、維細(xì)胞。而利用反轉(zhuǎn)錄PCR、熒光定量PCR和免疫熒光實(shí)驗(yàn)鑒定發(fā)現(xiàn)這類(lèi)細(xì)胞表達(dá)Sox2、Nestin、MSI1、CD133、N-CAM、DCX、Tuj1和MAP2等神經(jīng)元前體細(xì)胞的標(biāo)記，也表達(dá)增殖標(biāo)記基因Ki-67和趨化因子受體CXCR4，而不表達(dá)OCT4、PAX6、GFAP和NeuN，證明這些誘導(dǎo)獲得的hiNPR細(xì)胞中不含胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和成熟神經(jīng)元。體內(nèi)和體外分化實(shí)驗(yàn)證實(shí)，hiNRPs能分化為多種特定功能性神經(jīng)元，而不