瓊膠酶AgaXa結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的初步研究.pdf

1、瓊膠酶是一種降解瓊脂的多糖水解酶,降解瓊脂生成具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化以及美白效果的多聚寡糖,此外,瓊膠酶在生物科研領(lǐng)域還可以用于制備原生質(zhì)體、多糖結(jié)構(gòu)測定以及回收凝膠電泳核酸,因而對其研究也越來越多。本文中以瓊膠酶AgaXa為研究對象,對其結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系進行了研究,主要研究內(nèi)容如下:
　　首先,對從菌株Catenovulumsp.X3中克隆到的瓊膠酶基因agaXa采用易錯PCR的方法進行突變,經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)在Mg2+濃度為0

2、.5mM,Mn2+濃度為0.05mM、0.1mM時進行突變,突變率(約為0.2％-1.0%)比較符合實驗的預期要求。最后構(gòu)建突變文庫,并利用盧戈氏碘液染色方法進行快速篩選,獲得了8個活力與穩(wěn)定性發(fā)生變化的瓊膠酶突變體。
　　然后利用定點突變結(jié)合活力與熱穩(wěn)定性的定量分析,最終確定了Val197、Ile217、Pro259、Cys442、Cys528等五個氨基酸對酶活力與熱穩(wěn)定性有著關(guān)鍵性的作用,而且Val197、Pro259、Cys

3、442、Cys528的突變會引起構(gòu)象的改變。此外,發(fā)現(xiàn)30%的丙酮可以提高84%的酶活力,而實驗中的所有機溶劑對酶的穩(wěn)定性均沒有促進作用。實驗中金屬離子僅有Mg2+能部分增強酶穩(wěn)定性,而Al3+、Fe3+、Co2+、Ni2+卻可以顯著降低其穩(wěn)定性。AgaXa在室溫放置150天后的電泳和活力測定實驗均證實瓊膠酶AgaXa是一個穩(wěn)定性極強的蛋白。
　　IUPred和RONN的分析預測表明在AgaXa的N端和C端存在有無序區(qū)域,通過PC

4、R的方法切除兩端部分氨基酸構(gòu)建截短的突變體,活性測試證實截短兩端之后AgaXa完全喪失活性,且截短突變體AgaXa-N110和AgaXa-C513可以準確識別并綁定到瓊脂糖之上,表明AgaXa識別底物的CBM位于其中間部位而與催化水解活性相關(guān)的氨基酸位于其兩端的無序區(qū)域。而位于兩個β-折疊之間,可能是以轉(zhuǎn)角的形式存在的Gly221在發(fā)生突變后會導致蛋白無法識別并結(jié)合底物,證實其為AgaXa的結(jié)構(gòu)關(guān)鍵氨基酸,對AgaXa的正確折疊具有非常