家蠅Rabll基因鑒定及與免疫功能相關(guān)性的研究.pdf

1、Rabll蛋白是一種小 GTP酶，定位高爾基體反面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、胞質(zhì)中的囊泡以及感桿基底等膜系統(tǒng)中，與GTP的結(jié)合和水解過程相偶聯(lián)，在囊泡的出芽、轉(zhuǎn)運(yùn)、粘附、錨定和融合幾個(gè)階段起著重要的作用。作為能夠傳播多種疾病的病媒昆蟲，家蠅 Musca domestica常常生活在病原菌滋生的惡劣環(huán)境中，具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力。研究家蠅獨(dú)特的免疫調(diào)控機(jī)制，將為了解昆蟲生理、免疫以及殺蟲等方面提供新的思路。
　　本論文以家蠅為研究對(duì)象，研究?jī)?nèi)容主要分為

2、6個(gè)部分。
　　1.通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析、RT-PCR及RACE技術(shù)從家蠅幼蟲體內(nèi)克隆獲得類似Rabll基因的cDNA序列，經(jīng)過同源分析，將其命名為MdRabll，并對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行了分析。Rabll基因 cDNA全長(zhǎng)1220 bp，包含一個(gè)645 bp的完整開放閱讀框（ORF），根據(jù)ORF推導(dǎo)的Rabll肽由214個(gè)氨基酸殘基組成，經(jīng) SignalP程序預(yù)測(cè)此多肽不含有信號(hào)肽，理論分于質(zhì)量為24.29 kD，等電點(diǎn)為5.52。同

3、源性分析表明，與黑腹果蠅Drosophila melanogaster的Rabll相似性最高（identity=97％）
　　2.通過同源克隆得到家蠅-actin基因，檢測(cè)了-actin基因作為分于內(nèi)標(biāo)的可靠性。家蠅-actin基因 cDNA序列全長(zhǎng)1380 bp，包含一個(gè)長(zhǎng)度為1056 bp的開放閱讀框，編碼352個(gè)氨基酸，經(jīng) SignalP程序預(yù)測(cè)此多肽不含有信號(hào)肽，理論分于質(zhì)量為39.53 kD，等電點(diǎn)為5.47。該序列與許

4、多物種的序列一致性均高于94％。-actin表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果顯示熱激后不同恢復(fù)時(shí)間其表達(dá)量無明顯變化，且與未經(jīng)熱激處理的對(duì)照相比無顯著差異，可以作為研究受外界環(huán)境脅迫作用下昆蟲體內(nèi)不同基因表達(dá)水平高低的可靠?jī)?nèi)部參照標(biāo)準(zhǔn)。
　　3.以家蠅管家基因-actin及GAPDH作為內(nèi)參分于，利用實(shí)時(shí)定量 RT-qPCR對(duì)經(jīng)大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）刺激，不同組織，

5、家蠅 Rabll基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。以基因定量結(jié)果顯示，菌協(xié)迫后家蠅體內(nèi) Rabll的表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化，而且大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別刺激后，Rabll基因的表達(dá)變化模式非常相似，都在刺激48 h的時(shí)候達(dá)到高蜂。在家蠅不同組織中，Rabll表達(dá)量在腸和血淋巴中較高，其中在血淋巴中的表達(dá)量最高；而在表皮中的表達(dá)量較低。
　　4.構(gòu)建了家蠅 Rabll基因的原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌 DE3體內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并

6、用Rabll蛋白免疫新西蘭大白兔制備了抗血清。
　　5.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，飼喂能夠有效抑制蟲體中Rabll基因表達(dá)的干擾菌，并用針刺法對(duì)幼蟲進(jìn)行大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）刺激。在刺激后，與未經(jīng) Rabll菌體飼喂的家蠅幼蟲相比，飼喂組存活率明顯降低。
　　6.構(gòu)建 EGFP-Rabll熒光載體，利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法研究其在草地夜蛾細(xì)胞中的定位情況。