PD-1基因多態(tài)性及其表達(dá)水平與急性前葡萄膜炎易感性及免疫功能的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　急性前葡萄膜炎是葡萄膜炎中最常見(jiàn)的類(lèi)型，為T(mén)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫失衡所致的自身免疫性疾病。程序性死亡受體1（PD-1）是抑制活化T細(xì)胞的重要負(fù)向調(diào)控因子，在維持人體內(nèi)環(huán)境免疫平衡中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)收集大量急性前葡萄膜炎患者和健康人外周血中細(xì)胞的基因組DNA，對(duì)PD-1基因上SNP位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)分析，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析明確PD-1基因多態(tài)性與急性前葡萄膜炎的相關(guān)性。另外，建立急性前葡萄膜炎的動(dòng)物模型，即實(shí)驗(yàn)性自身免

2、疫性葡萄膜炎動(dòng)物模型（experimental autoimmune uveitis,EAU），檢測(cè)脾臟和頸部淋巴結(jié)中PD-1和PD-L1基因在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)mRNA的表達(dá)情況；同時(shí)，檢測(cè)急性前葡萄膜炎患者和健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞中PD-1和PD-L1基因mRNA的表達(dá)水平，以及Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、INF-γ+IL17+T細(xì)胞比例的變化情況，旨在了解免疫耐受調(diào)控信號(hào)通路中的PD-1/PD-L1在急性前葡萄膜炎中的作用。
　　方法：

3、
　　1.收集2015年3月到2016年12月于眼視光醫(yī)院就診的397例研究對(duì)象，其中
　　符合要求的急性前葡萄膜炎患者166例，以及健康對(duì)照組231例。通過(guò)Haploview軟件選取3個(gè)tagSNP分別為rs10204525、rs2227982、rs41386349參與本次的研究。采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）或測(cè)序的方法進(jìn)行基因多態(tài)性的分型檢測(cè)。采用卡方檢驗(yàn)或Fisher檢驗(yàn)對(duì)兩組之間的等位基因和基因型的頻

4、率比較分析，P值采用Bonferroni矯正。
　　2.雄性 Lewis大鼠50只隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和正常組。實(shí)驗(yàn)組在皮下注射乳化的IRBP多肽（光感受器維生素A類(lèi)結(jié)合蛋白）建立EAU動(dòng)物模型。從免疫注射后的第一天開(kāi)始觀察各組大鼠的眼部變化情況。分別檢測(cè)免疫后第8、11、14、17、20天五個(gè)時(shí)間點(diǎn)大鼠頸部淋巴結(jié)和脾臟中 PD-1、PD-L1、Foxp3、IFN-γ基因mRNA表達(dá)水平的改變。
　　3.本研究進(jìn)一步檢測(cè) PD-1

5、表達(dá)在急性前葡萄膜炎中的影響。收集2016年11月至2016年12月之間于眼視光醫(yī)院就診的符合要求的急性前葡萄膜炎患者12例并且同時(shí)收集了12例來(lái)院健康體檢者作為對(duì)照組。該部分實(shí)驗(yàn)主要檢測(cè)內(nèi)容有：1）提取兩組被檢樣本外周血中單個(gè)核細(xì)胞的RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后通過(guò)熒光定量PCR的方法檢測(cè)免疫調(diào)控基因PD-1與PD-L1 mRNA的表達(dá)水平；2）采用流式細(xì)胞儀技術(shù)分別檢測(cè)了疾病組和健康對(duì)照組外周血中Th1細(xì)胞和IFN-γ+IL17+T細(xì)

6、胞比例的變化情況。
　　結(jié)果：
　　1.按照病例收集要求收集166例 AAU患者，231例健康對(duì)照者。經(jīng)對(duì)比分析AAU組和健康對(duì)照組之間3個(gè)SNP位點(diǎn)（rs10204525、rs2227982、rs41386349）的等位基因以及基因型頻率，發(fā)現(xiàn)rs10204525A>G中GG基因型在AAU患者中明顯高于正常人。rs2227982和rs41386349兩個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因和基因型頻率在急性前葡萄膜炎（AAU）和健康對(duì)照組

7、之間沒(méi)有明顯的差異。進(jìn)一步在分層分析中，在HLA-B27陽(yáng)性的急性前葡萄膜炎患者中，rs41386349的CC基因型明顯高于正常對(duì)照組；HLA-B27陰性的急性前葡萄膜炎患者中， rs2227982的TT基因型明顯高于正常對(duì)照組；rs2227982、rs41386349在HLA-B27陽(yáng)性和陰性患者之間分布沒(méi)有差異；另外急性前葡萄膜炎不伴發(fā)強(qiáng)直性脊柱炎的患者中rs2227982的TT基因型明顯高于對(duì)照組，而CT基因型頻率明顯低于對(duì)照組；

8、與伴發(fā)強(qiáng)直性脊柱炎患者相比，不伴發(fā)強(qiáng)直性脊柱炎患者中rs2227982基因的CT基因型明顯降低；在女性中，可以發(fā)現(xiàn)rs2227982的TT基因型明顯高于對(duì)照組。
　　2.成功建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎動(dòng)物模型，在動(dòng)態(tài)觀察中可以觀察到從免疫注射后的第八天開(kāi)始眼部出現(xiàn)癥狀，第11天到第14天為眼部炎癥癥狀的高峰期，其后逐漸減輕，到第20天眼部癥狀基本消失。從熒光定量 PCR的結(jié)果可以看出模型組大鼠頸部淋巴結(jié)細(xì)胞和脾臟組織中，重要免疫

9、耐受調(diào)控基因PD-1、PD-L1 mRNA表達(dá)量明顯增加，F(xiàn)oxp3作為T(mén)reg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子在疾病初期mRNA表達(dá)量下降，后隨著PD-1、PD-L1的表達(dá)升高而上升。IFN-γmRNA則在疾病中的表達(dá)量明顯增高。
　　3.急性前葡萄膜炎患者和健康對(duì)照組的熒光定量 PCR的結(jié)果來(lái)看，PD-1基因的表達(dá)在患者組和健康對(duì)照組之間不明顯,而PD-L1 mRNA的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果：急性前

10、葡萄膜炎患者中，Th1細(xì)胞比例為（14.35±1.48）％，與對(duì)照組相比明顯升高；IFN-γ+IL17+T細(xì)胞比例為（0.22±0.03）%與對(duì)照組相比有顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.證實(shí)了PD-1的基因多態(tài)性與急性前葡萄膜炎相關(guān)。rs10204525的GG基因型是急性前葡萄膜炎患者的危險(xiǎn)因素；而 rs41386349的CC基因型與HLA-B27陽(yáng)性的急性前葡萄膜炎患者具有相關(guān)性，可能是導(dǎo)致發(fā)病的危險(xiǎn)因素。

11、rs2227982與HLA-B27陰性或不伴發(fā)強(qiáng)直性脊柱炎的急性前葡萄膜炎有明顯的相關(guān)性；與伴發(fā)強(qiáng)制性脊柱炎AAU患者相比，不伴發(fā)強(qiáng)直性脊柱炎AAU患者中rs2227982的CT基因型頻率明顯減低，是該病的保護(hù)因素；在女性中， rs2227982的TT基因型可能是患者的保護(hù)性因素。
　　2.在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)PD-1、PD-L1 mRNA表達(dá)量的變化與實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎的疾病進(jìn)程基本一致。PD-1/PD-L1信號(hào)可以促使