負(fù)責(zé)調(diào)控Brd4活性的HDAC鑒定.pdf

1、正性轉(zhuǎn)錄延伸因子P-TEFb是由CDK9及其調(diào)節(jié)亞基Cyclin T1組成的異二聚體激酶,廣泛存在于真核生物中。研究證明:P-TEFb是基因轉(zhuǎn)錄從起始階段進(jìn)入到有效延伸階段的必需因子,與艾滋病、心肌肥大和腫瘤發(fā)生均有密切的關(guān)系。在RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)主導(dǎo)的mRNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程中,P-TEFb被選擇性募集到基因啟動(dòng)子區(qū),進(jìn)而磷酸化PolⅡ及延伸抑制因子,刺激全長(zhǎng)mRNA的高效轉(zhuǎn)錄。在真核細(xì)胞內(nèi),P-TEFb以無(wú)活性和有活性(可募集)兩種

2、復(fù)合物形式存在。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞在受到外界脅迫因素刺激后,可以激活細(xì)胞內(nèi)鈣離子依賴性蛋白磷酸酶PP2B以及蛋白磷酸酶PPl兩條信號(hào)途徑,通過(guò)蛋白磷酸酶PP2B和PP1的協(xié)同去磷酸化作用,致使無(wú)活性復(fù)合物解離,從而釋放P-TEFb。被釋放的P-TEFb通過(guò)與募集因子溴結(jié)構(gòu)域蛋白Brd4的結(jié)合、被選擇性的募集到基因啟動(dòng)子區(qū),調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄?？梢?jiàn),Brd4對(duì)于P-TEFb的募集和發(fā)揮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄功能起到了至關(guān)重要的作用。因此,Br

3、d4調(diào)控P-TEFb募集機(jī)制的研究對(duì)于我們深入研究基因表達(dá)具有非常重要的意義。Brd4的兩個(gè)串聯(lián)的溴結(jié)構(gòu)域可通過(guò)識(shí)別核小體乙?；M蛋白而結(jié)合于染色質(zhì)上。我們前期報(bào)道已證明,當(dāng)細(xì)胞受到刺激后,Brd4可以從染色質(zhì)上解離下來(lái),進(jìn)而與已經(jīng)活化的P-TEFb結(jié)合,并將P-TEFb募集到基因啟動(dòng)子區(qū),從而調(diào)控應(yīng)激性基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)(我們將該過(guò)程稱為Brd4的應(yīng)激活化);并發(fā)現(xiàn)用特異的組蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制劑TSA預(yù)處理細(xì)胞,會(huì)抑制Brd4

4、的應(yīng)激活化,顯示HDACs信號(hào)途徑參與了這個(gè)過(guò)程。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,共有11個(gè)HDACs基因,分為4大類。然而調(diào)控Brd4應(yīng)激活化的特異HDACs類型還不清楚。
　　 本文研究目標(biāo)是甑別與鑒定調(diào)控Brd4應(yīng)激活化相關(guān)HDACs信號(hào)途徑的特異HDACs類型。我們首先采用MS-275預(yù)處理細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)可以抑制Brd4的應(yīng)激活化。MS-275是針對(duì)HDACⅠ類(主要是HDAC1,2,3)的特異性抑制劑,因此我們推測(cè)上述現(xiàn)象的發(fā)生是與HD

5、ACⅠ類有關(guān)的。為了檢驗(yàn)這個(gè)推測(cè),我們克隆了針對(duì)HDAC1,2,3的shRNA,采用病毒包裝感染細(xì)胞抑制HDAC1,2,3的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單抑制其中一個(gè)或兩個(gè)HDACs都不能阻斷Brd4的應(yīng)激活化,必須是同時(shí)抑制三個(gè)HDACs才能起到阻斷效果。表明HDAC1-3都參與了Brd4應(yīng)激活化的調(diào)控。接下來(lái)我們用過(guò)表達(dá)無(wú)活性HDACs(即對(duì)HDACs進(jìn)行定點(diǎn)突變),發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)HDAC1+3或2+3均可阻斷Brd4的應(yīng)激活化,而過(guò)表達(dá)HDAC1+

6、2則不能抑制這個(gè)過(guò)程。這些結(jié)果顯示HDACs具有功能性冗余。有趣的是,這也說(shuō)明無(wú)活性HDAC3突變體與無(wú)活性HDAC1或2突變體共同作用就足以抑制信號(hào)引起的Brd4應(yīng)激活化,提示HDAC1和HDAC2可能共用一個(gè)調(diào)節(jié)亞基或是兩者形成了一個(gè)復(fù)合物。意外的是,共表達(dá)HDAC1,2,3并不能直接導(dǎo)致Brd4的活化。提示Brd4的應(yīng)激活化可能還需要另外一條途徑的協(xié)同或過(guò)表達(dá)的HDAC1,2,3本身也需要被應(yīng)激活化,才能有效調(diào)控Brd4的活化。尤