家蠶BH4合成代謝途徑的基因鑒定與表達(dá)調(diào)控功能研究.pdf

1、四氫生物蝶呤（tetrahydrobiopterin, BH4）是芳香族氨基酸羥化酶的必需輔酶，同時(shí)，也是一氧化氮合酶和烷基甘油單加氧酶必需的輔因子，其合成不足或代謝缺陷會(huì)導(dǎo)致哺乳動(dòng)物罹患多種神經(jīng)性疾病。目前研究得比較清楚的是 BH4的生物合成分為三條途徑，即以 GTP為初始底物，經(jīng)過(guò)三個(gè)酶的催化最終生成BH4的從頭合成途徑，以中間產(chǎn)物墨蝶呤為底物，經(jīng)過(guò)兩步反應(yīng)生成BH4的補(bǔ)救合成途徑，以及BH4參與催化反應(yīng)后，經(jīng)過(guò)兩個(gè)酶的催化重新生成

2、BH4的重生途徑。但是BH4生物合成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中尚存不明之處：當(dāng)從頭合成途徑受阻或部分受阻發(fā)生時(shí)，選擇性合成支路及其調(diào)控因子的作用機(jī)制有待探明；不同合成途徑在生物體內(nèi)的時(shí)空作用模式及功能地位尚不清楚。家蠶（Bombyx mori）作為鱗翅目的模式昆蟲(chóng)，遺傳背景清晰，目前基因組框架圖和精細(xì)圖均已完成，數(shù)據(jù)庫(kù)信息完善。國(guó)內(nèi)外保存有數(shù)百種家蠶突變體種質(zhì)資源，包括很多研究人類疾病相關(guān)問(wèn)題的寶貴生物資源。家蠶黃體色lemon（lem）、黃體色致死

3、lemon lethal（leml）以及白化致死體albino（al）等突變體是不同程度的BH4合成缺陷型，是研究 BH4合成代謝途徑及其調(diào)控機(jī)理的理想模型。本研究利用家蠶野生型品系大造（p50），BH4合成相關(guān)突變品系以及家蠶 BmN細(xì)胞系為材料，對(duì)家蠶BH4合成代謝途徑的基因進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)克隆鑒定，表達(dá)互作模式及其調(diào)控BH4合成功能等方面的研究，主要獲得以下結(jié)果：
　　1.從家蠶野生型品系p50五齡三天的幼蟲(chóng)中克隆得到了BH4重生途

4、徑中的蝶呤-4α-甲醇胺脫水酶基因（BmPcd）和二氫喋啶還原酶基因（BmDhpr），通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)基因與其他物種相應(yīng)基因的同源性較高，與果蠅的同源性最高。對(duì)兩個(gè)基因在不同突變品系中的時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因的時(shí)空表達(dá)模式存在較大差異。通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化得到了BmPCD和 BmDHPR蛋白，對(duì)重組 BmDHPR蛋白進(jìn)行了酶學(xué)特性鑒定，重組BmDHPR蛋白在室溫和pH為7的條件下活性最高，對(duì)輔酶NADH的

5、親和性大于NADPH，對(duì)底物DMPH2親和性較差顯示出較高的底物專一性?；趐50和lem突變體品系 ah09的體內(nèi)比較酶活實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)從頭合成途徑受阻導(dǎo)致BH4合成不足時(shí)，B. mori主要激活腦和性腺等組織的重生途徑。
　　2.針對(duì) BH4從頭合成途徑中的墨蝶呤還原酶基因 BmSpr，補(bǔ)救合成途徑中的二氫葉酸還原酶基因BmDhfr和重生途徑中的BmDhpr等基因分別設(shè)計(jì)了2-4條合適的shRNA，并構(gòu)建了相應(yīng)的RNA干涉載

6、體。分析了不同轉(zhuǎn)染試劑對(duì)干涉載體轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響，并利用熒光定量RT-PCR的方法篩選出了干涉效果較好的shRNA干涉載體。在BmN細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)干涉BmDhfr的表達(dá)對(duì)其他BH4合成相關(guān)基因的表達(dá)無(wú)明顯影響，但干涉BmSpr的表達(dá)使BmPtps和BmDhfr的表達(dá)明顯上調(diào)。以上結(jié)果說(shuō)明BH4的從頭合成途徑受到抑制時(shí)，補(bǔ)救合成途徑可能會(huì)發(fā)揮積極作用；相較SPR來(lái)說(shuō)，GTPCH和PTPS是BH4從頭合成途徑的更為重要的限速酶。另

7、外，通過(guò)蠶卵顯微注射的方式進(jìn)行了shRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因干涉BmSpr表達(dá)的初步實(shí)驗(yàn)。
　　3.以哺乳動(dòng)物參與BH4合成相關(guān)的醛酮還原酶（AR）和羰基還原酶（CR）的氨基酸序列為查詢對(duì)象，在中日家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和全長(zhǎng) cDNA文庫(kù)進(jìn)行同源基因BLAST檢索，共得到了14個(gè)家蠶醛酮還原酶基因（BmAr）的17個(gè)轉(zhuǎn)錄本，以及8個(gè)家蠶羰基還原酶基因（BmCr）的9個(gè)轉(zhuǎn)錄本，分別構(gòu)建了不同物種間AR的進(jìn)化樹(shù)和CR的進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)BmAR12和

8、BmAR13與已報(bào)道的BH4合成相關(guān)的AR親緣關(guān)系最近。半定量RT-PCR分析了所有BmAr, BmCr預(yù)測(cè)基因在p50和ah09品系中的表達(dá)差異模式，推定BmAR2和BmCR3可能參與家蠶BH4的合成代謝途徑。
　　綜上所述，補(bǔ)救途徑和回收途徑在家蠶 BH4合成代謝系統(tǒng)中可能具有較為重要的生物學(xué)功能，本研究所取得的進(jìn)展為今后全面闡釋家蠶 BH4合成代謝網(wǎng)絡(luò)的分子調(diào)控機(jī)制奠定了必要的生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為開(kāi)展將家蠶BH4