PRL-3通過調(diào)控RhoA活性及mDia表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷移侵襲.pdf

1、PRLs(phosphatases of regenerating liver)是一類蛋白酪氨酸磷酸酶(proteintyrosine phosphatase，PTP)，它們能夠通過調(diào)節(jié)酪氨酸殘基的磷酸化狀態(tài)實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)活性的調(diào)控，進(jìn)而參與多種細(xì)胞生命活動(dòng)。越來越多的研究結(jié)果提示PRL-3與腫瘤密切相關(guān)[1-5]。PRL-3在多種惡性腫瘤中均有不同程度的表達(dá)上調(diào)，尤其在轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)水平往往明顯高于原發(fā)灶。這些研究結(jié)果都提示PRL-3可能

2、有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的生物學(xué)作用，PRL-3可以作為腫瘤轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)記物[3]。我們課題組研究了94例非小細(xì)胞肺癌和癌旁正常組織中PRL-3的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌中PRL-3表達(dá)陽(yáng)性表達(dá)率為68％，PRL-3陽(yáng)性表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。但PRL-3調(diào)控肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不清楚。我們通過siRNA干擾肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中PRL-3表達(dá)，觀察肺癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲能力的改變，檢測(cè)RhoA活性及其下游蛋白m

3、diaphanous(mDia)的表達(dá)變化以深入揭示PRL-3影響肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的作用機(jī)制。 材料與方法： 1、細(xì)胞株與試劑 HBE(Normal human bronchial epithelial cells)，人肺腺癌細(xì)胞株A549、人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H661和NCI-H460、人肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系SK-MES-1。羊多克隆PRL-3抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，鼠單克隆mDial抗體購(gòu)自

4、BD生物科技公司；RT-PCR試劑盒購(gòu)自Takara公司；Lipofectamine TM2000購(gòu)自Invitrogen公司；PRL-3siRNA及亂序siRNA對(duì)照由Genzyme公司Beverly A Teicher惠贈(zèng)(Xeragon/Qiagen；target sequence：TGAGAGCGGGATGAAGTACGA：siRNA Negative-1，Ambion)。 2、細(xì)胞培養(yǎng) 人永生化正常支氣管上皮細(xì)

5、胞系HBE常規(guī)培養(yǎng)于含15％胎牛血清、100U/mL青/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中；人肺腺癌細(xì)胞A549、NCL-H661、NCLPH460、SK-MES-1常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清、100U/ml青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。RhoA，mDia抑制試驗(yàn)A549細(xì)胞在含anti-RhoA抗體，anti-mDia1抗體100ng/mLDMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)。 3、PRL-3 siR

6、NA轉(zhuǎn)染 收集指數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×109個(gè)/L，接種細(xì)胞至24孔培養(yǎng)板上，按每孔接種5×104個(gè)細(xì)胞，并設(shè)復(fù)孔3個(gè)以校正實(shí)驗(yàn)誤差．按Lipofectamin TM 2000操作說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。 4、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR) 提取細(xì)胞總RNA,按RT-PCR(TaKaRa)試劑盒方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為20μl，取2μl的RT產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體

7、系為20μL。 5、細(xì)胞免疫熒光染色 將胰酶消化后的細(xì)胞均勻接種在24孔板上，4％多聚甲醛室溫固定15min,正常山羊血清37℃封閉30min，滴加PRL-3一抗、二抗，或Phalloidin-TRITC(SIGMA)10μg/mL DAPI37℃孵育30min。 6、SDS-PAGE電泳和Western Blot 提取細(xì)胞總蛋白。電泳、轉(zhuǎn)印，一抗、二抗，DAB顯色。 7、生長(zhǎng)曲線測(cè)定(MTT)

8、 以103個(gè)細(xì)胞/孔的密度，將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每過24h每組各取6孔細(xì)胞檢測(cè)增殖情況。每孔內(nèi)加入20μL MTT溶液，150μLDMSO，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔的吸光值。 8、細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測(cè) 細(xì)胞遷移能力檢測(cè)，上室中加入100μL無血清DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞數(shù)為2.5×104個(gè)，下室加入600μL含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基。37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)6h

9、r后吸盡培養(yǎng)基，固定，蘇木素染色，鏡下觀察。細(xì)胞侵襲能力的測(cè)定用預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基以1:7稀釋Matrigel加入上室100μL，在室溫下放置6h。其他與遷移實(shí)驗(yàn)相同，培養(yǎng)18hr后觀察結(jié)果。 9、RhoA活性測(cè)定 實(shí)驗(yàn)按照G-LISATM RhoA Activation Assay Biochem Kit使用說明進(jìn)行操作。酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490nm檢測(cè)吸光度。 10、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟

10、件，兩組樣本采用t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組以上樣本采用方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、PRL-3 mRNA及蛋白在高轉(zhuǎn)移能力的A549細(xì)胞和NCI-H661細(xì)胞中高表達(dá)，在永生化正常人支氣管上皮細(xì)胞HBE中低表達(dá)。 2、PRL-3在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系A(chǔ)549中的定位不同于永生化的正常人支氣管上皮細(xì)胞系HBE。 3、PRL-3 siRNA有效地干擾了A549細(xì)胞中PRL-3 mRNA和蛋白的表達(dá)

11、。 RT-PCR和western blot檢測(cè)結(jié)果顯示當(dāng)轉(zhuǎn)染PRL siRNA 48h后，A549細(xì)胞PRL-3的mRNA和蛋白表達(dá)水平開始下降，至72h時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量達(dá)到最低。 4、特異性干擾PRL-3表達(dá)后A549細(xì)胞增殖能力未發(fā)生明顯變化。 5、特異性干擾PRL-3表達(dá)后A549細(xì)胞遷移、侵襲能力均顯著下降。 6、特異性干擾PRL-3表達(dá)后A549細(xì)胞RhoA活性顯著下降；mDia蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)

12、。 7、封閉RhoA，A549細(xì)胞mDia蛋白表達(dá)明顯降低，與正常A549細(xì)胞相比細(xì)胞內(nèi)F-actin表達(dá)明顯減弱，張力絲明顯減少，細(xì)胞未見明顯偽足形成；封閉mDia，與正常A549細(xì)胞相比細(xì)胞內(nèi)F-actin表達(dá)明顯減弱，張力絲明顯減少。 結(jié)論： 1、PRL-3的表達(dá)與肺癌細(xì)胞系的遷移侵襲能力有關(guān)。 2、PRL-3通過調(diào)控RhoA活性及mDia表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞F-actin骨架的形成從而實(shí)現(xiàn)促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷移