天津海河流域消毒劑抗性菌生物譜分析及抗性基因污染水平調查.pdf

1、研究背景:消毒是控制病原微生物傳播的主要措施，已廣泛應用于人們的日常生活、醫(yī)院、食品加工、日化用品和畜牧水產養(yǎng)殖等方面，但伴隨而來的細菌對消毒劑的抗性問題也引起了人們的重視。細菌對消毒劑產生抗性后，會出現(xiàn)選擇性細菌，即具有強的適應性和抵抗力的細菌得以存活，從而出現(xiàn)更難以控制和治愈的感染，消毒劑抗性菌已是導致醫(yī)院院內感染的主要因素。消毒劑抗性菌是指對常用消毒劑濃度不再敏感的菌株，也就是即在可以殺滅或抑制絕大部分細菌的消毒劑濃度下，消毒劑抗

2、性菌卻不能被殺滅或抑制。一般以分離菌株的最小抑菌濃度（MIC）或最小殺菌濃度（MBC）與標準菌株的MIC或MBC對比進行判定。
　　細菌對消毒劑產生抗性的機理主要包括固有性抗性和獲得性抗性兩個方面。固有性抗性主要是由細菌自身的某些結構或性能所決定的，例如細菌芽孢可以阻止消毒劑進入細菌體內，革蘭氏陰性菌因為其細胞壁結構與革蘭氏陽性菌不同而對消毒劑表現(xiàn)更強的耐受。獲得性抗性是指細菌從環(huán)境中獲得了某些消毒劑抗性基因，并且這些消毒劑抗性基

3、因在細菌體內表達而導致對消毒劑的抗性。消毒劑抗性基因按其表達方式主要分為質粒介導表達和染色體介導表達兩類。目前，對消毒劑抗性基因研究較多的是 QAC基因家族，研究發(fā)現(xiàn)有八種 QAC基因可以由質粒介導表達，包括 qacA/B、qacE、qacEΔ1、qacF、qacG、qacH、qacI以及sugE(p)，這些基因可以在細菌之間水平和垂直傳播。染色體介導表達的抗性基因 sugE(c)、emrE、ydgE/ydgF、mdfA，賦予了細菌對

4、QACs的抗性。消毒劑抗性基因可以在細菌之間接合轉移，其對環(huán)境微生物安全的影響不容忽視。
　　研究目的:本論文將以水環(huán)境微生物安全評價常用指標菌——大腸桿菌為對照，以常用消毒劑——次氯酸鈉、碘伏和苯扎溴銨為研究對象，針對天津海河流域開展消毒劑抗性菌抗性水平評估，并分析消毒劑抗性菌的生物譜，了解主要消毒劑抗性基因的污染水平，為消毒劑抗性菌的環(huán)境安全評價提供參考依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.天津海河流域水環(huán)境中消毒劑抗性

5、菌抗性水平評估：選擇天津海河流域不同地點采樣，以大腸桿菌ATCC25922為對照，選取次氯酸鈉、碘伏、苯扎溴銨3種消毒劑，通過MIC和MBC試驗，開展消毒劑抗性菌的抗性水平研究，并利用PCR技術分析典型消毒劑抗性基因在消毒劑抗性菌中的檢出情況。
　　2.天津海河流域水環(huán)境中消毒劑抗性菌生物譜分析：針對天津海河流域不同斷面采樣點的水樣，對MIC和MBC試驗樣品中最高消毒劑濃度下存活的抗性菌，利用16S rRNA擴增子測序技術，分析不

6、同水樣對3種消毒劑的MIC和MBC試驗樣品中消毒劑抗性菌的生物譜。
　　3.天津海河流域水環(huán)境中典型消毒劑抗性基因污染水平調查：正壓抽濾方法濃集水樣中細菌，利用試劑盒提取細菌基因組DNA，通過實時熒光定量PCR技術，采用SYBR GREEN染料法，對樣品中典型消毒劑抗性基因進行定量檢測。
　　研究結果:
　　1.天津海河流域水環(huán)境中消毒劑抗性菌抗性水平：ATCC25922對次氯酸鈉的MIC和MBC均為250 mg/L，

7、碘伏MIC為90 mg/L，MBC在90～120 mg/L，苯扎溴銨MIC和MBC均為60 mg/L。而各采樣點的次氯酸鈉MIC和MBC在850～1350 mg/L，碘伏MIC和MBC在120～270 mg/L，苯扎溴銨除南運河外其他采樣點MIC和MBC在90～270mg/L，均高于對照菌株。而在24個MIC樣品中，qacA/B和qacG基因均未檢出；qacEΔ1基因檢出率為（10/24），qacE、emrE基因檢出率為（3/24），s

8、ugE(p)基因檢出率為（2/24），sugE(c)檢出率為（6/24），ydgE/ydgF檢出率為（7/24）。
　　2.天津海河流域消毒劑抗性菌的生物譜分析：在次氯酸鈉、碘伏和苯扎溴銨共計38個MIC和MBC樣品中，變形菌門和厚壁菌門檢出相對較多。在南運河碘伏MIC中檢測到較高豐度的藍藻門和放線菌門，金剛橋苯扎溴銨MIC中也檢測到一定豐度的放線菌門。
　　次氯酸鈉MIC和MBC樣品中，檢出頻率相對較多的種屬有：芽孢桿菌屬

9、、假單胞菌屬、Jeotgalibacillus屬、枝芽孢桿菌屬以及賴氨酸芽孢桿菌屬。碘伏MIC和MBC樣品中，相對豐度較高的種屬有：假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、氣單胞菌屬、Synechococcus屬、乳酸桿菌屬。苯扎溴銨MIC和MBC樣品中，相對豐度較高的種屬有：假單胞菌屬、氣單胞菌屬、普羅維登斯菌屬、摩根菌屬、芽孢桿菌屬。
　　3.天津海河流域水環(huán)境中消毒劑抗性基因污染情況：水樣中季銨鹽類消毒劑抗性基因qacE、qacE△1和qa

10、cG基因在8個采樣點均有檢出，而qacA/B基因在8個采樣點均未檢出，ydgE和ydgF基因在上、中游采樣點均有檢出，sugE(c)、sugE(p)和emrE基因在南運河、金剛橋、大光明橋和外環(huán)路4個采樣點檢測為陽性。
　　qacE和qacE△1基因定量結果達到102-104拷貝/mL，qacG基因達到102-103拷貝/mL。染色體型消毒劑抗性基因sugE(p)、sugE(c)、emrE可以達到100～103拷貝/mL，而ydg