基于效應(yīng)標志物質(zhì)譜定量技術(shù)的有機磷毒物中毒與重活化特點研究.pdf

1、有機磷毒物屬于一類含磷有機物，有機磷毒物依效能可分為神經(jīng)性毒劑（Nerve agents,NAs）和有機磷農(nóng)藥（Organophosphoruspesticides）。急性有機磷中毒的救治策略主要是利用阿托品進行對癥治療以及利用肟類化合物進行對因治療。而阿托品僅作用于毒蕈堿型受體，救治效果不佳，增大用藥劑量又會引起阿托品中毒；因此肟類化合物作為一種特異性解毒藥被越來越廣泛地應(yīng)用于急性有機磷中毒的救治。但肟類重活化劑無法進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，

2、且目前對其重活化效果存在一定爭議：一種觀點認為肟類化合物通過重活化神經(jīng)或肌肉組織內(nèi)中毒乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase,AChE），從而恢復(fù)酶活性以及受損的身體機能；另一種觀點認為肟類化合物在重活化過程中可與游離毒劑或與離去的磷酸（或膦酸）基團發(fā)生反應(yīng)，形成一種膦?；恐虚g體，該中間體帶有季銨正電荷，更易攻擊帶有負電荷的酶活中心，故具有更強抑酶毒性，或許是造成肟類藥物重活化效果不佳甚至出現(xiàn)加深中毒現(xiàn)象的原因。

3、>　　目前對有機磷毒物中毒救治的研究工作多基于經(jīng)典的Ellman法等酶活測定法開展，然而Ellman法作為酶活測定的金標準，依然存在一定的局限性，例如，AChE的測定易受丁酰膽堿酯酶（Butyrylcholinesterase,BChE）干擾，準確度低；靈敏度低，當(dāng)中毒濃度低于20％時，無法準確測定；同時測定酶活時，體系中其他膽堿酯酶抑制劑或重活化劑等藥物的存在會造成一定干擾，導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果；更為重要的是該方法特異性較差，無法分

4、辨中毒類型，同時無法準確描述AChE所處的狀態(tài)（活性態(tài)、中毒態(tài)、老化態(tài)）。本課題研究建立了一種液相色譜-串級質(zhì)譜聯(lián)用（Liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）定量測定方法用于研究神經(jīng)性毒劑中毒特點與救治，該方法通過對毒物特異性加合肽段進行定量檢測，提供效應(yīng)酶中毒程度的數(shù)據(jù)，同時能夠定量獲取效應(yīng)酶中毒后所處的不同狀態(tài)，尤其是對于低劑量有機磷毒物暴露時，經(jīng)典Ellman

5、法無法準確獲得酶活性抑制率，而該方法對于抑制率小于1%的情況亦可進行準確分析。
　　本課題研究中，針對有機磷毒物中毒救治難題以及現(xiàn)有方法存在的諸多弊端，展開深入研究。本研究論文共分為四章：
　　第一章：前言，對有機磷毒物及其中毒機理、中毒救治研究方法、抗毒藥物概況進行了介紹，并提出本論文的研究意義與目的。
　　第二章：有機磷農(nóng)藥與AChE連接的基團多為二甲氧基膦?；鶊F（Dimethylphosphoryl,DMP）以及

6、二乙氧基膦?；鶊F（Diethylphosphoryl,DEP），本章針對這兩類結(jié)構(gòu)特點制備了二甲基膦?；浑暮投一Ⅴ；浑?，在此基礎(chǔ)上利用課題組前期研究建立針對有機磷農(nóng)藥中毒救治研究的LC-MS/MS定量測定方法，對常見有機磷農(nóng)藥敵敵畏、敵百蟲、久效磷、對氧磷的中毒特點及重活化特點進行考察，有機磷農(nóng)藥的中毒過程相對神經(jīng)性毒劑較為緩慢，四種有機磷農(nóng)藥的中毒速率由快至慢依次為對氧磷、敵百蟲、敵敵畏、久效磷。對于同一種有機磷農(nóng)藥，不同

7、重活化劑表現(xiàn)出不同的重活化效果：對于敵敵畏，雙復(fù)磷（Obidoxime,L-1656）的重活化效果更佳；對于敵百蟲，酰胺磷定（Asoxime,HI-6）的重活化效果更佳；對于久效磷，氯解磷定（Pralidoxime chloride,2-PAM）表現(xiàn)出顯著的重活化效果優(yōu)勢；對于對氧磷，三種重活化劑皆呈現(xiàn)良好的重活化效果，各重活化劑的抗毒效果呈現(xiàn)顯著差異，缺乏有效且廣譜的抗毒藥物；且通過比較發(fā)現(xiàn)，二乙氧基膦?；卸久篙^二甲氧基膦?；卸久?/p>

8、更易被重活化劑重活化。該評價工作對有機磷農(nóng)藥的合理使用、有機磷農(nóng)藥中毒的救治具有重要參考意義。
　　第三章：針對有機磷農(nóng)藥救治效果不佳的原因，推測有機磷農(nóng)藥與重活化劑形成的膦?；浚≒hosphoryl oxime,POX）是重活化效果的重要影響因素。為驗證推測，通過對氧磷與雙復(fù)磷在巴比妥緩沖液中直接反應(yīng)成功制備得到二者的反應(yīng)產(chǎn)物—DEP-obidoxime。在體外實驗中考察并比較對氧磷以及DEP-obidoxime對AChE的抑

9、制作用差異，利用對氧磷以及DEP-obidoxime對AChE染毒，然后基于酶解-質(zhì)譜法的分析策略，將中毒酶經(jīng)胃蛋白酶酶解后產(chǎn)生含有加合位點的特異肽段，利用基于效應(yīng)標志物的質(zhì)譜定量分析技術(shù)對特異性肽段進行定量檢測，實現(xiàn)對氧磷以及DEP-obidoxime中毒特點的考察，證實DEP-obidoxime具有較強的AChE抑制毒性，并進一步完成經(jīng)典重活化劑（氯解磷定、雙復(fù)磷、HI-6）抗毒效能評價工作，DEP-obidoxime膦?；腁Ch

10、E與對氧磷膦?；闹卸久缚赏瑯颖宦冉饬锥ㄖ鼗罨?，且重活化效果無顯著差異。同時半數(shù)有效濃度（Concentration for50%of maximal effect,EC50）數(shù)據(jù)表明，3種經(jīng)典重活化劑對對氧磷或DEP-obidoxime膦?；疉ChE的重活化效果由強至弱依次為：氯解磷定、HI-6、雙復(fù)磷。上述發(fā)現(xiàn)對于有機磷中毒的臨床救治用藥具有重要的參考價值。
　　第四章：針對本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)肟類重活化劑會加深梭曼（Som

11、an,GD）中毒的現(xiàn)象，推測肟類重活化劑作為抗毒藥物用于梭曼中毒救治過程中，可能與梭曼發(fā)生反應(yīng)，形成對AChE抑制毒性更大的膦?；浚蔀橹卸炯由畹母?。基于這一發(fā)現(xiàn)，本章開展肟類重活化劑加深梭曼中毒機制的研究。首先，采用光譜法和氣相色譜法對神經(jīng)性毒劑梭曼與重活化劑的相互作用展開研究，研究發(fā)現(xiàn)肟類重活化劑雙復(fù)磷、氯解磷定以及HI-6可與梭曼明顯發(fā)生反應(yīng)，而我所自主研發(fā)的叔胺類重活化劑L-1978、L-1655不與梭曼發(fā)生反應(yīng)。隨后在第三