快速老化小鼠SAMP8老化過程中自噬的改變以及mTOR信號通路功能研究.pdf

1、在受累腦區(qū)形成細胞內蛋白質聚集體是許多神經退行性疾病的共同特點，如阿爾茨海默?。ˋD），帕金森病(PD)和亨廷頓病，而這些蛋白質沉積多由泛素分子連接，提示蛋白質降解系統(tǒng)功能障礙。自噬溶酶體系統(tǒng)和泛素蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）是大多數腦細胞胞漿內聚集的或錯誤折疊蛋白的主要降解途徑。UPS選擇性的降解細胞內短壽命的錯誤折疊蛋白。而自噬與之相反，其選擇性較差，有助于降解長壽命的蛋白質和受損的細胞器（如線粒體），甚至某些細胞外的成分。自噬對保持神經

2、元的內穩(wěn)態(tài)至關重要，因其可以清除老化的有聚集傾向的且對細胞有害的蛋白質，并為蛋白質的合成提供大分子物質。自噬可以分為以下幾個步驟：首先包裹待降解底物形成雙層膜結構，稱為自噬體，之后自噬體與溶酶體結合形成自噬溶酶體，內容物被溶酶體內的水解酶降解，最后降解產物進入胞漿循環(huán)利用。自噬體和自噬溶酶體統(tǒng)稱為自噬小泡(AVs)，是自噬的主要形態(tài)學特征。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白激酶(mTOR)是自噬的一個抑制因子，是一個細胞內的保守激酶系統(tǒng)，是能量狀態(tài)

3、、生長因子和營養(yǎng)信號的中心傳感器，其活性可以被某些藥物抑制，如雷帕霉素等。
　　 AD是一種神經退行性疾病，主要特點為進行性癡呆，形態(tài)學改變包括腦萎縮、具有β淀粉樣蛋白（Aβ）沉積的老年斑、神經元內具有tau蛋白異常磷酸化的神經元纖維纏結(NFT)。在AD患者的尸檢標本中發(fā)現腦內營養(yǎng)缺乏而腫脹的突起內聚集了大量AVs，這表明AD的發(fā)病過程中有自噬系統(tǒng)參與。在散發(fā)性AD和PS1/APP轉基因小鼠腦內發(fā)病早期自噬被誘導，并不是淀粉樣

4、蛋白沉積引起的后果，而大部分的Aβ在AD患者腦內可在溶酶體內正常降解。
　　 老化是AD的主要危險因素，因為細胞和器官由于蛋白質和受損細胞器異常聚積而功能逐漸下降是一個普遍現象。許多證據顯示，自噬溶酶體系統(tǒng)的增齡性功能障礙可能是衰老過程中異常蛋白質聚集的原因。老化過程中自噬功能的下降可以決定細胞和個體的壽命。誘導神經元內的自噬，可以使老齡果蠅的壽命延長56％，若抑制自噬，則壽命會縮短，并能觀察到神經退行性改變。最近有研究顯示，t

5、au蛋白磷酸化可通過PI3K/mTOR信號轉導通路進行調節(jié)。在AD患者腦內的研究進一步證實了mTOR和Tau蛋白之間的聯系，研究表明mTOR信號在有可能生成NFTs的神經元內選擇性的增強，并且這種增強與tau蛋白磷酸化相關。這些證據表明，在老化過程中mTOR信號的長期增強可以促進Tau蛋白的病理變化。有研究已經證實，長期給予雷帕霉素或敲除mTOR的靶點p70S6K可以延長小鼠的壽命，可能會起到延緩衰老的作用。
　　 快速老化小鼠

6、（SAMP8）是由日本京都大學竹田俊男教授由AKR/J小鼠開發(fā)而來，以學習記憶功能呈增齡性加速衰退為主要特征，該小鼠成為了研究老化和學習記憶障礙的理想哺乳動物模型之一。SAMP8小鼠不但具有一些與老年人相似的特征，如壽命短、駝背、活動減少、毛發(fā)稀少等，還具有神經退行性變的特征，如早發(fā)的學習記憶障礙、情緒變化、生理節(jié)律異常、腦內神經元丟失和神經遞質釋放減少。SAMR1不表現出這些老化特征，一般作為其對照小鼠。值得關注的是，SAMP8小鼠還

7、具有一些蛋白修飾的改變，如年齡相關的Tau蛋白異常磷酸化和Aβ沉積，與AD患者腦內的變化相似。
　　 到目前為止，還沒有關于SAMP8小鼠增齡性腦內自噬活性改變的研究，以及自噬功能的改變是否與其老化和認知功能改變有關。為了更好的理解老化、自噬以及神經退行性變三者之間的關系，在本研究中，我們研究了SAMP8小鼠在老化過程中不同腦區(qū)的自噬增齡性改變，并進一步研究了mTOR信號轉導通路在SAMP8小鼠老化和神經退行性變過程中的作用。<

8、br>　　 1、快速老化小鼠SAMP8體內外增齡性神經退行性變
　　 目的：研究SAMP8小鼠腦內體內體外的增齡性的神經退行性變，為下一步研究提供理論基礎。
　　 方法：用Morris水迷宮評測2、7和12月齡SAMP8和SAMR1小鼠的學習和空間記憶能力。原代神經元取自新生SAMP8和SAMR1小鼠的海馬，在培養(yǎng)第10天進行免疫熒光染色。利用Western-blot檢測磷酸化Tau蛋白的水平。
　　 結果：S

9、AMP8和SAMR1小鼠在2月齡時的學習和空間記憶能力無明顯差別，與SAMR1小鼠相比，在7(P＜0.05)和12(P＜0.05)月齡時SAMP8小鼠出現明顯的學習記憶功能下降。在培養(yǎng)第10天時，SAMP8組神經元細胞狀態(tài)較差，突起較細且短，部分突起出現斷裂，突起上呈現出“串珠樣”改變。而對照組SAMR1小鼠則細胞狀態(tài)較好，無此變化。Western-blot結果顯示，在SAMR1小鼠的海馬和皮質區(qū)Tau[pS199]水平在7(P＜0.0

10、5)和12月齡(P＜0.05)均出現了明顯增多。而SAMP8來源的神經元在培養(yǎng)10天時Tau[pS199]和Tau[pS396]的水平均較對照組明顯提高。
　　 結論：SAMP8小鼠表現出年齡相關的神經退行性變特征，如在7和12月齡時表現出學習和記憶能力下降，Tau蛋白磷酸化水平增高。與SAMR1小鼠相比，新生SAMP8小鼠來源的原代神經元也表現出一定的神經退行性改變。以上結果提示，在本實驗室飼養(yǎng)的SAMP8小鼠能夠穩(wěn)定的表現出

11、認知功能下降以及退行性變相關的神經病理學改變，為下一步研究打下了良好的基礎。
　　 2、快速老化小鼠SAMP8腦內年齡相關的自噬改變
　　 目的：研究SAMP8小鼠腦內年齡相關的自噬改變以及這些改變是否在其老化以及認知功能下降過程中發(fā)揮作用。
　　 方法：利用透射電鏡觀察SAMP8和SAMR1小鼠海馬神經元的超微結構以及AVs的變化。利用免疫組化以及Western-blot觀察在2、7和12月齡SAMP8和SAM

12、R1小鼠海馬和皮質內泛素陽性蛋白、LC3以及Beclin1的表達。
　　 結果：在海馬的CA3和皮質區(qū)，7(P＜0.05)和12月齡(P＜0.05)SAMP8小鼠的泛素陽性蛋白的OD值明顯高于同齡的SAMR1小鼠。在12月齡的SAMP8小鼠的海馬和皮質區(qū)泛素陽性蛋白呈現出聚集狀態(tài)。
　　 透射電鏡觀察發(fā)現，2月齡的SAMP8和SAMR1小鼠海馬神經元內線粒體、細胞核以及其他細胞器狀態(tài)均正常，很少見到AVs。在7月齡的SA

13、MP8小鼠海馬神經元內細胞核出現固縮變形，線粒體輕度腫脹、脊和膜輕度消失，內質網腫脹，胞漿內有少量的密度不勻的致密物，可能為降解的細胞器或者脂褐素沉積，有些被雙層膜結構包裹，可以觀察到少量的雙層膜的AVs。而與2月齡的SAMR1小鼠相比，7月齡的SAMR1小鼠海馬神經元超微結構無明顯變化。12月齡的SAMP8小鼠海馬神經元細胞狀態(tài)很差，出現胞漿空泡化，核質邊移，細胞器減少、線粒體數量減少，線粒體腫脹、脊和膜消失，粗面內質網脫顆粒，在胞漿

14、和軸突內可見到大量的致密物以及AVs。而12月齡的SAMR1小鼠則變化較輕微，僅有少量致密物沉積，AVs少見。
　　 在海馬CA1和CA3區(qū)免疫組化染色發(fā)現，與同齡SAMR1小鼠相比，2月齡的SAMP8小鼠的LC3的陽性顆粒較多，但LC3-Ⅱ/β-actin的比值無統(tǒng)計學意義。在7(P＜0.05)和12月齡(P＜0.05)的SAMP8小鼠海馬CA1和CA3區(qū)免疫組化染色較對照組明顯增強，以CA3區(qū)較明顯，western blot

15、結果提示差異有統(tǒng)計學意義。在皮質區(qū)LC3的表達變化與海馬區(qū)相似，7和12月齡的SAMP8小鼠的表達明顯增強。與對照組相比，SAMP8小鼠在海馬和皮質區(qū)的Beclin1表達在7月齡明顯增加，12月齡時出現明顯下降。
　　 結論：SAMP8小鼠的大部分神經退行性改變從7月齡開始出現，而自噬活性在7月齡先出現升高，12月齡時出現了明顯下降。隨著快速老化過程的進展，自噬活性在12月齡時出現下降，這一變化與AD患者的變化類似，提示從自噬這

16、一角度來說，12月齡SAMP8小鼠的病理學改變與晚發(fā)性AD更加相似。充分了解SAMP8小鼠自噬活性的增齡性改變有助于進行更深入的研究，如治療AD以及抗老化的藥物研究。
　　 3、mTOR信號通路參與SAMP8小鼠老化過程中自噬活性的調節(jié)
　　 目的：探討mTOR信號通路是否在SAMP8小鼠的神經退行性變過程中發(fā)揮作用，給予雷帕霉素是否可改善SAMP8小鼠神經退行性變。
　　 方法：原代神經元培養(yǎng)同前，在培養(yǎng)第7天

17、時加入0.5或1.0μM雷帕霉素，作用3天后進行免疫熒光染色或者Western-blot分析。用Western-blot檢測磷酸化p70S6K、總的mTOR、磷酸化mTOR、Bcl-2以及Tau[pS199]和Tau[pS396]的表達變化。
　　 結果：在老齡的SAMP8小鼠海馬區(qū)mTOR(pSer2448)(P＜0.01)和p70S6K(pThr389)(P＜0.01)的水平較對照組明顯提高。
　　 免疫熒光染色結果

18、顯示，SAMR1來源的神經元細胞狀態(tài)較好，突起平滑且較長。而未處理組的SAMP8來源的神經元狀態(tài)較差，大部分突起斷裂，并呈現串珠樣改變。加入0.5μM雷帕霉素狀態(tài)較未處理組好，部分細胞的突起平滑細長，但仍有部分神經元突起斷裂或沒有突起。加入1.0μM雷帕霉素的SAMP8神經元，細胞狀態(tài)較未處理更差，大部分細胞沒有突起，部分細胞已經死亡。
　　 SAMP8神經元組的Tau[pS199](P＜0.01)和Tau[pS396](P＜0

19、.01)均明顯高于對照SAMR1組，給予0.5μM雷帕霉素預處理3天后Tau[pS199]（P＜0.05）和Tau[pS396](P＜0.05)都出現降低。加入0.5μM雷帕霉素可以提高SAMP8神經元內LC3-Ⅱ(P＜0.05)和Beclin1(P＜0.05)的水平，并減少p70S6K(pThr389)(P＜0.05)的水平，對mTOR(pSer2448)(P＞0.05)水平無影響。雷帕霉素可以使神經元內Bcl-2的水平降低。

20、　　 結論：mTOR信號通路參與了SAMP8小鼠的神經神經退行性變的發(fā)生，給予雷帕霉素可以保護神經元，減少Tau蛋白的異常磷酸化。提示雷帕霉素可能可以改善SAMP8小鼠的認知功能下降。
　　 綜上所述，SAMP8小鼠在7月齡時開始出現學習和和記憶能力下降，Tau蛋白磷酸化增多，此時待降解蛋白增多，自噬小泡增多，自噬活性提高。在12月齡時SAMP8小鼠學習和和記憶能力持續(xù)下降，Tau蛋白磷酸化明顯增多，此時細胞內待降解蛋白呈聚集

21、狀態(tài)，在電鏡下可見大量呈團塊狀的致密物和自噬小泡聚集，說明此時存在著自噬小泡清除障礙，并且出現mTOR信號通路活性提高，均提示老齡SAMP8小鼠腦內自噬活性下降。以上結論均揭示SAMP8小鼠腦內存在著年齡相關的自噬活性改變，自噬可能參與了SAMP8小鼠腦老化過程。而在老齡SAMP8小鼠腦內以及SAMP8來源的原代海馬神經元內均存在著自噬活性下降，mTOR通路活性提高，給予雷帕霉素抑制mTOR通路活性后可以保護神經元，降低神經元內Tau蛋