GmSARK和AtSARK基因調(diào)控葉片衰老分子機(jī)制的研究.pdf

1、葉片衰老是受遺傳程序嚴(yán)格控制的、植物個(gè)體發(fā)育過(guò)程中的一個(gè)必經(jīng)階段，與其它發(fā)育過(guò)程一樣，是由特殊發(fā)育信號(hào)通過(guò)一定的信號(hào)傳導(dǎo)路徑來(lái)啟動(dòng)和控制的。植物L(fēng)RR型類(lèi)受體蛋白激酶(LRR-RLKs)已被證明參與多種生命活動(dòng)，并在其中發(fā)揮著重要功能。
　　 我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，一個(gè)大豆的LRR-RLK，GmSARK，具有雙底物特異性，它可以在體外自磷酸化絲/蘇氨酸殘基和酪氨酸殘基；同時(shí)發(fā)現(xiàn)GmSARK參與大豆葉片衰老的調(diào)控，利用RNA干擾

2、技術(shù)敲減GmSARK表達(dá)可以明顯延緩轉(zhuǎn)基因大豆衰老，而利用CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GmSARK組成型過(guò)表達(dá)則導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因大豆、番茄和擬南芥早衰致死；由于GmSARK-RNAi轉(zhuǎn)基因大豆的花發(fā)育異常，具有一個(gè)細(xì)彎的柱頭和不開(kāi)放的花瓣而導(dǎo)致不育，所以不能使用上述兩種轉(zhuǎn)基因材料對(duì)GmSARK的功能進(jìn)行具體分析。為了進(jìn)一步研究GmSARK的功能及其參與衰老信號(hào)調(diào)控的分子機(jī)制，本文在以前研究的基礎(chǔ)上，以GVG系統(tǒng)可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(誘導(dǎo)劑為地塞米松de

3、xamethasone，DEX)控制GmSARK表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)GmSARK所介導(dǎo)的葉片衰老尤其是幾種不同的植物激素在其中的調(diào)控作用進(jìn)行了更為深入的分析。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，外源誘導(dǎo)GmSARK過(guò)表達(dá)可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗產(chǎn)生早衰、彎曲根表型；導(dǎo)致成熟轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片衰老加速、產(chǎn)生與組成型乙烯超響應(yīng)突變體類(lèi)似花等表型；并導(dǎo)致一些衰老關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子AtNAP、NAC1、NAC2和WRKY6等的表達(dá)量上升。
　　

4、 在葉片衰老過(guò)程中，葉綠體結(jié)構(gòu)與功能的破壞和葉綠素含量的下降是該過(guò)程的標(biāo)志性事件；通過(guò)透射電鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，外源誘導(dǎo)GmSARK過(guò)表達(dá)可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥葉綠體結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，造成其內(nèi)部簡(jiǎn)單、類(lèi)囊體數(shù)目明顯減少并積累大量淀粉顆粒；利用啟動(dòng)子-報(bào)告基因β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase，GUS)系統(tǒng)，對(duì)三種葉綠體功能缺陷型突變體背景下GmSARK-GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)葉綠體功能缺陷又反饋促進(jìn)GmSARK-GUS的活性

5、，形成一個(gè)滾動(dòng)環(huán)使葉片衰老進(jìn)入不可逆轉(zhuǎn)的階段。
　　 利用基因芯片技術(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在過(guò)表達(dá)GmSARK的轉(zhuǎn)基因擬南芥中，有大量激素相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生變化，其中變化最明顯的是生長(zhǎng)素和乙烯。我們研究了細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素和乙烯與GmSARK之間發(fā)揮作用的關(guān)系。
　　 外源施加細(xì)胞分裂素可以有效抑制GmSARK-GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥中GmSARK啟動(dòng)子活性，外源施加生長(zhǎng)素和乙烯前體ACC都可以促進(jìn)GmSARK-GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥

6、中GmSARK啟動(dòng)子活性；另外，外源誘導(dǎo)GmSARK過(guò)表達(dá)可以有效降低細(xì)胞分裂素合成和信號(hào)響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，可以促進(jìn)生長(zhǎng)素和乙烯的合成和響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)。同時(shí)，過(guò)表達(dá)GmSARK導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)外源生長(zhǎng)素的敏感性增強(qiáng)；通過(guò)檢測(cè)人工合成的生長(zhǎng)素響應(yīng)元件DR5的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)GmSARK不僅改變根中生長(zhǎng)素的濃度，還改變了其分布情況。
　　 通過(guò)外源激素處理與藥物抑制劑結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雖然外源細(xì)胞分裂素能夠強(qiáng)烈抑制GmSAR

7、K啟動(dòng)子的活性，但只能部分恢復(fù)由GmSARK過(guò)表達(dá)所造成的幼苗早衰表型，而外源施加生長(zhǎng)素作用抑制劑PCIB和乙烯合成抑制劑AVG能夠有效恢復(fù)由GmSARK過(guò)表達(dá)造成的早衰表型；PCIB的衰老恢復(fù)作用可以被外源ACC所逆轉(zhuǎn)，而AVG的衰老恢復(fù)作用不能被外源IAA逆轉(zhuǎn)；同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在生長(zhǎng)素輸入載體突變體aux1-7和乙烯不敏感突變體ein2-1中過(guò)表達(dá)GmSARK不僅不能引起轉(zhuǎn)基因擬南芥早衰，還可以恢復(fù)由GmSARK過(guò)表達(dá)造成的花發(fā)育異常

8、。以上結(jié)果表明，生長(zhǎng)素和乙烯直接參與GmSARK介導(dǎo)的葉片衰老信號(hào)，并在其中發(fā)揮十分重要的作用，尤其是生長(zhǎng)素促進(jìn)的乙烯合成增加和信號(hào)響應(yīng)增強(qiáng)是導(dǎo)致這個(gè)過(guò)程中衰老事件發(fā)生和衰老過(guò)程加速的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。我們據(jù)此提出GmSARK和GmSARK類(lèi)基因參與葉片衰老調(diào)控的模型，并對(duì)細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素和乙烯三種激素在GmSARK所介導(dǎo)的葉片衰老過(guò)程中的協(xié)同作用進(jìn)行了分析和討論。
　　 我們首次在擬南芥中分離鑒定了GmSARK的同功能基因AtSAR

9、K。實(shí)驗(yàn)室同期生化實(shí)驗(yàn)證明，AtSARK也是一個(gè)新的、定位在質(zhì)膜的、具有雙底物特異性的LRR-RLK。定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在擬南芥自然衰老還是由GmSARK過(guò)表達(dá)造成的早衰過(guò)程中，AtSARK的表達(dá)量都顯著上升。通過(guò)對(duì)AtSARK T-DNA插入突變體和過(guò)表達(dá)AtSARK轉(zhuǎn)基因擬南芥系統(tǒng)的表型分析發(fā)現(xiàn)，敲減AtSARK表達(dá)可以有效延緩葉片衰老，而外源誘導(dǎo)AtSARK過(guò)表達(dá)則可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥早衰并產(chǎn)生異常的、與過(guò)表達(dá)GmS

10、ARK類(lèi)似的花；同時(shí)外源抑制劑處理實(shí)驗(yàn)也表明生長(zhǎng)素和乙烯直接參與由AtSARK介導(dǎo)的衰老信號(hào)通路。因此，我們認(rèn)為由SARKs介導(dǎo)的衰老信號(hào)通路在高等植物中普遍存在。
　　 最后，我們又從擬南芥中分離和鑒定了一個(gè)參與葉片衰老負(fù)調(diào)控的蛋白磷酸酶編碼基因，我們將其命名為SSPP。定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在擬南芥自然衰老還是由SARKs過(guò)表達(dá)造成的早衰過(guò)程中，SSPP的表達(dá)都顯著下降。對(duì)組成型過(guò)表達(dá)SSPP的轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行表型

11、分析，發(fā)現(xiàn)其葉片葉綠素含量升高，具有晚花、晚衰、生活史延長(zhǎng)等表型；令人興奮的是，組成型過(guò)表達(dá)SSPP可以有效逆轉(zhuǎn)由AtSARK過(guò)表達(dá)造成的轉(zhuǎn)基因擬南芥早衰。此外，我們還發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SSPP可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗干旱能力和對(duì)高溫敏感性增強(qiáng)。
　　 綜上所述，本課題研究了大豆葉片衰老相關(guān)的LRR-RLK基因GmSARK及其在擬南芥中同功能基因AtSARK參與葉片衰老調(diào)控的分子機(jī)制，結(jié)合葉片衰老負(fù)調(diào)控因子、功能未知蛋白磷酸酶編碼基因S