新胃癌抑制基因HoxD10的分子調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、胃癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展涉及癌基因活化和抑癌基因失活。DNA啟動(dòng)子高甲基化被認(rèn)為是抑癌基因失活的最重要機(jī)制之一。尋找和驗(yàn)證新的抑癌基因?qū)沂疚赴┬碌姆肿影l(fā)病機(jī)制，確定生物學(xué)靶標(biāo)干預(yù)癌變有重要意義。
　　 HoxD10屬Hox基因家族的一員，其表達(dá)產(chǎn)物是重要的轉(zhuǎn)錄因子。HoxD10在胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞分化和形態(tài)發(fā)育控制起重要作用，也是課題組前期通過CpG島和cDNA微陣列分析篩選到的可能與胃癌相關(guān)的新的候選基因，其

2、與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系需要深入研究。
　　 本研究將通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)明確HoxD10對(duì)胃癌生物學(xué)行為(細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移)的影響；探討并揭示胃癌HoxD10的基因啟動(dòng)子是否被甲基化修飾及啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)對(duì)胃癌診治的潛在價(jià)值；采用表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選HoxD10基因調(diào)控的下游關(guān)鍵基因并進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步闡明HoxD10對(duì)胃癌抑制作用及相關(guān)凋亡信號(hào)通路的分子調(diào)控機(jī)制。
　　 研究步驟
　　 1.HoxD10在胃癌中的

3、表達(dá)及對(duì)胃癌的生物學(xué)行為的影響
　　 ①qPCR檢測(cè)33對(duì)胃癌及正常組織中HoxD10基因mRNA表達(dá)水平；PCR和Western blot檢測(cè)8種胃癌細(xì)胞株中的HoxD10的表達(dá)；
　　 ②克隆形成實(shí)驗(yàn)和MTS實(shí)驗(yàn)觀察過表達(dá)HoxD10對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響；
　　 ③采用流式細(xì)胞儀分析HoxD10對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響；Transwell實(shí)驗(yàn)研究HoxD10對(duì)胃癌細(xì)胞遷移及侵襲的影響；
　　 ④

4、裸鼠皮下荷瘤模型驗(yàn)證過表達(dá)HoxD10對(duì)胃癌生長(zhǎng)的影響。
　　 2.胃癌中HoxD10基因的啟動(dòng)子甲基化研究及其對(duì)胃癌診治的潛在的價(jià)值
　　 ①對(duì)不同胃癌細(xì)胞株進(jìn)行了5-Aza-dC去甲基化處理，RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)藥物處理前后HoxD10的表達(dá)情況；
　　 ②甲基化特異PCR(MSP)檢測(cè)不同胃癌細(xì)胞株啟動(dòng)子甲基化情況；并檢測(cè)正常胃組織、胃癌前狀態(tài)和胃癌不同階段HoxD10啟動(dòng)子甲基化

5、的頻度。
　　 3.HoxD10調(diào)控靶基因及凋亡相關(guān)信號(hào)通路的研究
　　 ①利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選HoxD10調(diào)控的下游靶基因。對(duì)其中9個(gè)候選靶基因在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HoxD10的MKN28胃癌細(xì)胞中進(jìn)行qPCR驗(yàn)證；
　　 ②Western blot檢測(cè)HoxD10對(duì)IGFBP3和凋亡調(diào)控通路關(guān)鍵蛋白(caspase3和caspase8)表達(dá)的影響。
　　 研究結(jié)果
　　 1.HoxD10能抑制胃癌

6、的生長(zhǎng)和侵襲
　　 ①HoxD10在胃癌組織中mRNA表達(dá)水平較正常組織明顯下調(diào)(P<0.001)，在系列胃癌細(xì)胞株中均呈現(xiàn)顯著低表達(dá)或沉默表達(dá)。
　　 ②過表達(dá)HoxD10能明顯抑制胃癌細(xì)胞株AGS和MKN28的增殖(p<0.01)。
　　 ③過表達(dá)HoxD10能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞周期S期，并顯著抑制AGS細(xì)胞的遷移和侵襲(p<0.01)。
　　 ④裸鼠胃癌移植瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HoxD10能顯著抑制

7、腫瘤的生長(zhǎng)(p<0.01)。
　　 2.啟動(dòng)子DNA甲基化是HoxD10表達(dá)下調(diào)的重要調(diào)控機(jī)制
　　 ①胃癌細(xì)胞株中HoxD10均呈下降或沉默表達(dá)，經(jīng)啟動(dòng)子去甲基化(5-aza)藥物處理后HoxD10恢復(fù)表達(dá)或表達(dá)增強(qiáng)。
　　 ②MSP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HoxD10基因啟動(dòng)子在3個(gè)胃癌細(xì)胞株(MKN28、MKN45和NCI-N87)中全部甲基化，在1個(gè)胃癌細(xì)胞株(AGS)中有部分甲基化。
　　 ③胃癌組織中HoxD

8、10啟動(dòng)子甲基化頻度最高(85.7％，24/28)，胃癌前狀態(tài)(腸上皮化生)組織亦存在高頻度甲基化(60％，18/30)，正常組織無甲基化或低甲基化(0/10)。
　　 3.HoxD10調(diào)控多個(gè)重要下游基因，并參與相關(guān)凋亡信號(hào)通路調(diào)控
　　 ①篩選到HoxD10的下游調(diào)控基因：34個(gè)上調(diào)和50個(gè)下調(diào)基因。這些基因主要參與細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲等重要細(xì)胞生物學(xué)功能。qRT-PCR證實(shí)其中HCLS1、ANP32A、PDGFRL

9、、IGFBP3和CXCL9的mRNA水平明顯升高，而RAC2、NTS、KRT5和TUSC3的mRNA水平明顯下降，其結(jié)果與基因芯片表達(dá)譜吻合。
　　 ②過表達(dá)HoxD10后，AGS和MKN28細(xì)胞中IGFBP3表達(dá)水平明顯升高，Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase8的蛋白表達(dá)水平亦明顯升高。
　　 研究結(jié)論
　　 1.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)HoxD10在胃癌中表達(dá)顯著下調(diào)，過表達(dá)HoxD10能

10、抑制胃癌生長(zhǎng)和腫瘤侵襲。HoxD10有望成為新的胃癌抑制基因。
　　 2.發(fā)現(xiàn)HoxD10基因在胃癌中表達(dá)下調(diào)與啟動(dòng)子DNA甲基化密切相關(guān)。HoxD10啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)有望作為胃癌前病變和癌變監(jiān)測(cè)的重要生物標(biāo)記物，HoxD10啟動(dòng)子去甲基化有可能成為潛在的癌變干預(yù)手段。
　　 3.篩選到HoxD10調(diào)控的系列下游基因，這些基因參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)過程。并發(fā)現(xiàn)HoxD10具有上調(diào)IGFBP3候選靶基因，激活