新胃癌抑制基因HoxD10的分子調控機制研究.pdf

1、胃癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展涉及癌基因活化和抑癌基因失活。DNA啟動子高甲基化被認為是抑癌基因失活的最重要機制之一。尋找和驗證新的抑癌基因對揭示胃癌新的分子發(fā)病機制，確定生物學靶標干預癌變有重要意義。
　　 HoxD10屬Hox基因家族的一員，其表達產物是重要的轉錄因子。HoxD10在胚胎發(fā)育過程中細胞分化和形態(tài)發(fā)育控制起重要作用，也是課題組前期通過CpG島和cDNA微陣列分析篩選到的可能與胃癌相關的新的候選基因，其

2、與胃癌發(fā)生發(fā)展的關系需要深入研究。
　　 本研究將通過體內外實驗明確HoxD10對胃癌生物學行為(細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移)的影響；探討并揭示胃癌HoxD10的基因啟動子是否被甲基化修飾及啟動子甲基化檢測對胃癌診治的潛在價值；采用表達譜芯片技術篩選HoxD10基因調控的下游關鍵基因并進行驗證，進一步闡明HoxD10對胃癌抑制作用及相關凋亡信號通路的分子調控機制。
　　 研究步驟
　　 1.HoxD10在胃癌中的

3、表達及對胃癌的生物學行為的影響
　　 ①qPCR檢測33對胃癌及正常組織中HoxD10基因mRNA表達水平；PCR和Western blot檢測8種胃癌細胞株中的HoxD10的表達；
　　 ②克隆形成實驗和MTS實驗觀察過表達HoxD10對胃癌細胞增殖的影響；
　　 ③采用流式細胞儀分析HoxD10對胃癌細胞凋亡和細胞周期的影響；Transwell實驗研究HoxD10對胃癌細胞遷移及侵襲的影響；
　　 ④

4、裸鼠皮下荷瘤模型驗證過表達HoxD10對胃癌生長的影響。
　　 2.胃癌中HoxD10基因的啟動子甲基化研究及其對胃癌診治的潛在的價值
　　 ①對不同胃癌細胞株進行了5-Aza-dC去甲基化處理，RT-PCR和Western blot分別檢測藥物處理前后HoxD10的表達情況；
　　 ②甲基化特異PCR(MSP)檢測不同胃癌細胞株啟動子甲基化情況；并檢測正常胃組織、胃癌前狀態(tài)和胃癌不同階段HoxD10啟動子甲基化

5、的頻度。
　　 3.HoxD10調控靶基因及凋亡相關信號通路的研究
　　 ①利用基因表達譜芯片技術篩選HoxD10調控的下游靶基因。對其中9個候選靶基因在穩(wěn)定轉染HoxD10的MKN28胃癌細胞中進行qPCR驗證；
　　 ②Western blot檢測HoxD10對IGFBP3和凋亡調控通路關鍵蛋白(caspase3和caspase8)表達的影響。
　　 研究結果
　　 1.HoxD10能抑制胃癌

6、的生長和侵襲
　　 ①HoxD10在胃癌組織中mRNA表達水平較正常組織明顯下調(P<0.001)，在系列胃癌細胞株中均呈現顯著低表達或沉默表達。
　　 ②過表達HoxD10能明顯抑制胃癌細胞株AGS和MKN28的增殖(p<0.01)。
　　 ③過表達HoxD10能促進細胞凋亡，抑制細胞周期S期，并顯著抑制AGS細胞的遷移和侵襲(p<0.01)。
　　 ④裸鼠胃癌移植瘤實驗發(fā)現過表達HoxD10能顯著抑制

7、腫瘤的生長(p<0.01)。
　　 2.啟動子DNA甲基化是HoxD10表達下調的重要調控機制
　　 ①胃癌細胞株中HoxD10均呈下降或沉默表達，經啟動子去甲基化(5-aza)藥物處理后HoxD10恢復表達或表達增強。
　　 ②MSP檢測發(fā)現HoxD10基因啟動子在3個胃癌細胞株(MKN28、MKN45和NCI-N87)中全部甲基化，在1個胃癌細胞株(AGS)中有部分甲基化。
　　 ③胃癌組織中HoxD

8、10啟動子甲基化頻度最高(85.7％，24/28)，胃癌前狀態(tài)(腸上皮化生)組織亦存在高頻度甲基化(60％，18/30)，正常組織無甲基化或低甲基化(0/10)。
　　 3.HoxD10調控多個重要下游基因，并參與相關凋亡信號通路調控
　　 ①篩選到HoxD10的下游調控基因：34個上調和50個下調基因。這些基因主要參與細胞增殖、凋亡和侵襲等重要細胞生物學功能。qRT-PCR證實其中HCLS1、ANP32A、PDGFRL

9、、IGFBP3和CXCL9的mRNA水平明顯升高，而RAC2、NTS、KRT5和TUSC3的mRNA水平明顯下降，其結果與基因芯片表達譜吻合。
　　 ②過表達HoxD10后，AGS和MKN28細胞中IGFBP3表達水平明顯升高，Cleaved-caspase3和Cleaved-caspase8的蛋白表達水平亦明顯升高。
　　 研究結論
　　 1.體內外實驗證實HoxD10在胃癌中表達顯著下調，過表達HoxD10能

10、抑制胃癌生長和腫瘤侵襲。HoxD10有望成為新的胃癌抑制基因。
　　 2.發(fā)現HoxD10基因在胃癌中表達下調與啟動子DNA甲基化密切相關。HoxD10啟動子甲基化檢測有望作為胃癌前病變和癌變監(jiān)測的重要生物標記物，HoxD10啟動子去甲基化有可能成為潛在的癌變干預手段。
　　 3.篩選到HoxD10調控的系列下游基因，這些基因參與腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲等生物學過程。并發(fā)現HoxD10具有上調IGFBP3候選靶基因，激活