祛風(fēng)通竅方對(duì)血管性癡呆模型大鼠作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　通過(guò)觀察祛風(fēng)通竅方對(duì)血管性癡呆（VD）大鼠定位航行、空間探索能力，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)，ChAT、Tau、Aβ、VEGF蛋白表達(dá)，IL-1β、IL-6、TNF-α濃度的影響，探討祛風(fēng)通竅方對(duì)血管性癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的保護(hù)作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.分組：水迷宮篩選符合實(shí)驗(yàn)要求大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、尼莫地平組、模型組、祛風(fēng)通竅方高、中、低劑量組，每組大鼠各10只。
　　2.給藥方法：高

2、、中、低劑量組分別給予祛風(fēng)通竅方26.8g/kg/d、13.4g/kg/d、6.7g/kg/d灌胃（按照等體積3ml的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算高、中、低劑量組大鼠灌胃藥物的濃度）。模型組、假手術(shù)組予以3ml生理鹽水灌胃。尼莫地平組予以尼莫地平混懸液6.25mg/kg/d灌胃。每天上午灌胃一次，連續(xù)30天。
　　3.取材方法：配置戊巴比妥鈉濃度1％，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉。大鼠仰臥位固定于消毒實(shí)驗(yàn)臺(tái)，開(kāi)胸取血，離心,取上清液，-20℃冰箱保存，用于

3、ELISA檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度。采集血液后，一部分大鼠迅速斷頭取出新鮮腦組織，將腦組織置于EP管中保存，用于半定量PCR及Western Blot檢測(cè)VEGF蛋白。另一部分大鼠進(jìn)行灌注取腦，用于HE染色和免疫組化檢測(cè)ChAT、Tau、Aβ蛋白。
　　4.觀察指標(biāo)：Morris水迷宮檢測(cè)大鼠定位航行、空間探索能力；HE染色光鏡觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)；免疫組化檢測(cè)ChAT、Tau、Aβ蛋白表達(dá)；ELI

4、SA法檢測(cè)IL-6、IL-1β、TNF-α濃度；半定量PCR法測(cè)定VEGFmRNA表達(dá)；Western Blot法檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.行為學(xué)：與假手術(shù)組比較，高、中、低劑量組、模型組、尼莫地平組大鼠EL延長(zhǎng)，第I象限游泳的時(shí)間縮短，經(jīng)過(guò)原平臺(tái)范圍的次數(shù)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），高劑量組大鼠EL隨著訓(xùn)練時(shí)間延長(zhǎng)而縮短，從第四天開(kāi)始接近于假手術(shù)組。與模型組比較，高、中、低劑量組、尼莫地平組

5、大鼠的EL隨著訓(xùn)練時(shí)間延長(zhǎng)而縮短，第I象限游泳的時(shí)間延長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)原平臺(tái)范圍的次數(shù)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與尼莫地平組比較，低劑量組EL隨著訓(xùn)練時(shí)間延長(zhǎng)而縮短，第I象限游泳的時(shí)間延長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)原平臺(tái)范圍的次數(shù)增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；高、中劑量組大鼠EL隨著訓(xùn)練時(shí)間延長(zhǎng)而縮短，第I象限游泳的時(shí)間延長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)原平臺(tái)范圍的次數(shù)增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。其中，以高劑量組大鼠行為學(xué)改善更為明顯，與中劑量組

6、比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2.HE染色：同倍率光鏡下觀察,假手術(shù)組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊，胞質(zhì)均質(zhì)紅染，胞核大而圓，核仁清晰明顯。模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，數(shù)量減少，細(xì)胞輪廓、胞核模糊，部分甚至看不到細(xì)胞。高、中劑量組神經(jīng)細(xì)胞排列比較規(guī)則，細(xì)胞輪廓、核膜與核仁比較清晰，且高劑量組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)優(yōu)于中劑量組，更為接近正常形態(tài)。低劑量組和尼莫地平組的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)介于模型組與中劑量組之間。

7、　　3.ChAT、Tau、Aβ蛋白檢測(cè)：ChAT、Tau、Aβ陽(yáng)性細(xì)胞均表現(xiàn)為胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色的沉淀物。
　?、貱hAT蛋白：與假手術(shù)組比較，模型組、各給藥組ChAT蛋白MOD值有所降低（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組ChAT蛋白MOD值有所升高（P<0.05）。與尼莫地平組比較，低劑量組ChAT蛋白MOD值升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05)；高、中劑量組ChAT蛋白MOD值有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）

8、。其中，以高劑量組升高最為明顯，與中劑量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?、赥au蛋白：與假手術(shù)組比較，模型組、各給藥組Tau蛋白MOD值有所升高（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組Tau蛋白MOD值降低（P<0.05）。與尼莫地平組比較，低劑量組Tau蛋白MOD值降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；高、中劑量組Tau蛋白MOD值有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。其中，以高劑量組降低最為明顯，與中劑

9、量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?、跘β蛋白：與假手術(shù)組比較，模型組、各給藥組Aβ蛋白MOD值有所升高（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組Aβ蛋白MOD值有所降低（P<0.05）。與尼莫地平組比較，低劑量組Aβ蛋白MOD值降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；高、中劑量組Aβ蛋白MOD值有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。其中，以高劑量組降低最為明顯，與中劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）

10、。
　　4.IL-6、IL-1β、TNF-α檢測(cè)：與假手術(shù)組比較，模型組、各給藥組IL-6、IL-1β、TNF-α濃度有所升高（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組IL-6、IL-1β、TNF-α濃度降低（P<0.05）。與尼莫地平組比較，高、中、低劑量組IL-6、IL-1β、TNF-α濃度有所降低（P<0.05）。其中，以高劑量組降低最為明顯，與中劑量組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.VEGFmRNA表達(dá)檢測(cè)：與假手

11、術(shù)組相比，模型組、各給藥組VEGFmRNA表達(dá)有所增加（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組VEGFmRNA表達(dá)有所增加（P<0.05）。與尼莫地平組比較，低劑量組VEGFmRNA表達(dá)增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；高、中劑量組VEGFmRNA表達(dá)有所增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。其中，以高劑量組增加最為明顯，與中劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　6.VEGF蛋白表達(dá)檢測(cè)：與假手術(shù)組相比，模

12、型組、各給藥組VEGF蛋白表達(dá)有所增加（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組VEGF蛋白表達(dá)有所增加（P<0.05）。與尼莫地平組比較，低劑量組VEGF蛋白表達(dá)增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；高、中劑量組VEGF蛋白表達(dá)有所增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。其中，以高劑量組增加最為明顯，與中劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.血管性癡呆大鼠存在學(xué)習(xí)記憶能力的下降；海馬CA1區(qū)

13、神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)紊亂，ChAT蛋白表達(dá)降低,Tau、Aβ蛋白表達(dá)升高，IL-6、IL-1β、TNF-α的濃度升高，VEGF表達(dá)增加。
　　2．祛風(fēng)通竅方能有效改善VD大鼠的行為學(xué)，保護(hù)VD大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)。
　　3．祛風(fēng)通竅方對(duì)血管性癡呆模型大鼠的作用機(jī)制可能與以下有關(guān)：
　?、偕险{(diào)VD大鼠ChAT的表達(dá)，改善膽堿能系統(tǒng)的功能；
　?、谝种芕D大鼠腦內(nèi)Tau蛋白過(guò)度磷酸化，降低Aβ蛋白表達(dá)，減少神經(jīng)元