ANKRD49通過NF-κB信號(hào)通路抑制UV誘導(dǎo)小鼠精原細(xì)胞凋亡的初步研究.pdf

1、目的：
　　運(yùn)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建ankrd49真核表達(dá)重組質(zhì)粒并建立ankrd49穩(wěn)定過表達(dá)的小鼠精原細(xì)胞系（GC-1）細(xì)胞模型；分析ankrd49過表達(dá)對(duì)UV誘導(dǎo)GC-1細(xì)胞凋亡的影響，探討NF-κB信號(hào)通路是否參與ANKRD49對(duì)UV誘導(dǎo)GC-1細(xì)胞凋亡的調(diào)控，并進(jìn)一步探討ANKRD49蛋白激活NF-κB信號(hào)通路的具體機(jī)制，為深入研究該基因的作用及其在精子發(fā)生中的調(diào)控機(jī)制提供思路。
　　方法：
　　1.利用分子克隆

2、技術(shù)構(gòu)建 ankrd49真核表達(dá)重組質(zhì)粒pMSCVpuro-ankrd49-flag；
　　2.建立ankrd49穩(wěn)定過表達(dá)的GC-1細(xì)胞模型，并采用RT-PCR和Western blotting檢測(cè)ankrd49 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平；
　　3.通過Hoechst33258染色對(duì)紫外線（UV）誘導(dǎo)的GC-1細(xì)胞凋亡狀況進(jìn)行分析；
　　4.運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過表達(dá)ankrd49基因?qū)V誘導(dǎo)的GC-1細(xì)胞凋亡率和

3、線粒體膜電位下降率的影響；
　　5.運(yùn)用Caspase-3酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)過表達(dá)ankrd49基因?qū)C-1細(xì)胞Caspase-3酶活性的影響；
　　6.利用Western blotting檢測(cè)過表達(dá)ankrd49基因后GC-1細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白多聚ADP核糖聚合酶—PARP（poly ADP-ribose polymerase）、Cleaved-Caspase-3、Bcl-xL和Bax的表達(dá)變化；
　　7.利用流

4、式細(xì)胞術(shù)、Caspase-3酶活性檢測(cè)試劑盒和免疫印跡技術(shù)分別檢測(cè)過表達(dá)ankrd49的GC-1細(xì)胞中加入NF-κB信號(hào)通路抑制劑（PDTC）后，GC-1細(xì)胞的凋亡率、Caspase-3酶活性和凋亡相關(guān)蛋白PARP、Cleaved-Caspase-3、Bcl-xL和Bax的表達(dá)變化情況；
　　8.分別提取過表達(dá)組和空載體組細(xì)胞胞漿總蛋白和核蛋白，并采用Western blotting檢測(cè)p65蛋白的亞細(xì)胞定位。
　　結(jié)果：<

5、br>　　1. PCR擴(kuò)增、雙酶切分析及DNA序列測(cè)定結(jié)果均表明真核表達(dá)重組質(zhì)粒pMSCVpuro-ankrd49-flag構(gòu)建成功；
　　2. RT-PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示ankrd49基因在GC-1細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定過表達(dá)；
　　3. Hoechst33258染色結(jié)果顯示， ankrd49穩(wěn)定過表達(dá)組細(xì)胞的凋亡百分比為（0.03±0.01）×100％，明顯低于空載體組（0.23±0.05）×1

6、00%和裸細(xì)胞組（0.25±0.04）×100%，（P<0.01）；
　　4.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示過表達(dá)ankrd49組細(xì)胞的早期凋亡率為2.71%±0.50%，明顯低于空載體組11.66%±1.01%和裸細(xì)胞組11.31%±1.74%，過表達(dá)ankrd49組細(xì)胞的線粒體膜電位下降率為11.51%±1.53%，明顯低于空載體組和裸細(xì)胞組（30.54%±2.42%和28.99%±1.61%），（P<0.01）；
　　5. Cas

7、pase-3酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)ankrd49組細(xì)胞Caspase-3酶活性為1.09±0.15，明顯低于空載體組（3.01±0.32）和裸細(xì)胞組（3.12±0.23），（P<0.01）；
　　6. Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示 ankrd49穩(wěn)定過表達(dá)組 Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase-3蛋白的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，而Bcl-xL蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組；
　　7.過表達(dá)a

8、nkrd49的GC-1細(xì)胞中加入NF-κB信號(hào)通路抑制劑（PDTC）后，經(jīng)過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明PDTC處理組細(xì)胞早期凋亡率明顯高于PDTC未處理組（P<0.01），Caspase-3酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PDTC處理組Caspase-3酶活性明顯升高（P<0.01），Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示PDTC處理組細(xì)胞內(nèi)Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase-3蛋白的表達(dá)水平明顯增高，而Bcl-xL蛋白表達(dá)水平明

9、顯降低（P<0.05）；
　　8.提取空載體組和過表達(dá)組細(xì)胞胞漿和核蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，結(jié)果表明ANKRD49可以促進(jìn)p65蛋白入核（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建了ankrd49的真核表達(dá)重組質(zhì)粒，并建立ankrd49穩(wěn)定過表達(dá)GC-1細(xì)胞模型。
　　2. ANKRD49蛋白對(duì)UV誘導(dǎo)GC-1細(xì)胞凋亡具有抑制作用。
　　3. ANKRD49蛋白通過激活NF-κB信