ACE2基因過表達(dá)對(duì)糖尿病心肌病內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、[研究背景]:
　　有研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)參與了糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)的病理過程，最終引起心肌功能的損害。目前認(rèn)為，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)對(duì)DCM的形成和發(fā)展起著重要作用。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin-converting enzyme 2，AC

2、E2)是RAS的新成員，主要分布于腎臟和心血管的內(nèi)皮細(xì)胞。ACE2的主要功能是水解血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)生成Ang(1-7)進(jìn)而對(duì)機(jī)體發(fā)揮保護(hù)作用。有研究顯示，循環(huán)系統(tǒng)中ACE2水平的升高使RAS偏于ACE2-Ang1-7-Mas軸發(fā)揮作用。在ACE2-Ang 1-7-Mas軸中ACE2通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號(hào)通路抑制

3、AngⅡ?qū)е碌男募〖?xì)胞肥厚和重塑。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2terminal protein Kinase，JNK)和p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在炎癥與細(xì)胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。因此，我們?cè)贒CM動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上通過基因轉(zhuǎn)染使ACE2基因過表達(dá)，觀察ACE2對(duì)糖尿病心肌病心肌病理改變的影響及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響。
　　[研究目的]:
　　1.構(gòu)建糖尿病心肌病動(dòng)物模型。
　　2.明確內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子

4、表達(dá)情況。
　　3.檢測(cè)ACE2基因轉(zhuǎn)染后心肌ACE2蛋白表達(dá)。
　　4.觀察ACE2基因轉(zhuǎn)染對(duì)糖尿病心肌病大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，并探討其發(fā)揮作用的可能機(jī)制。
　　[研究方法]:
　　1.DCM大鼠模型的建立
　　雄性Wistar大鼠64只，體重約200-220g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（n=12只）和造模組（n=52只）。標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)1周后，禁食12h，造模組大鼠給予鏈脲佐菌素(STZ)65mg/kg腹腔

5、內(nèi)注射，正常對(duì)照組大鼠注射等量檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖液。糖尿病大鼠成模的診斷標(biāo)準(zhǔn)為:連續(xù)2次空腹血糖＞16.7mmol/L。血糖升高后，繼續(xù)喂養(yǎng)3個(gè)月，最終獲得50只糖尿病心肌病大鼠。將糖尿病心肌病大鼠隨機(jī)分為三個(gè)組:ACE2組(n=16只)心肌注射100μl(1×109pfu)攜帶ACE2基因的重組腺病毒;EGFP組（n=17只）心肌注射等量的空載重組腺病毒即增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent pr

6、otein，EGFP);DCM組(n=17只)心肌注射等量的無菌生理鹽水。STZ注射前和注射后一周，測(cè)量各組大鼠空腹血糖。其中DCM組死亡1只，最終獲得ACE2組(n=16只)，EGFP組（n=17只）及DCM組（n=16只）?；蜣D(zhuǎn)染后15天從ACE2組和EGFP組及DCM組每組取6只大鼠處死，應(yīng)用Western blot檢測(cè)ACE2蛋白表達(dá)情況。應(yīng)用彩色多普勒超聲心動(dòng)圖儀對(duì)各組大鼠的心臟功能進(jìn)行檢查，檢測(cè)的指標(biāo)包括:左室舒張末期內(nèi)徑

7、(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end systolic diameter，LVESD)，射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)，左心室縮短分?jǐn)?shù).(fractional shortening，F(xiàn)S)。ELISA檢測(cè)心肌AngⅡ含量。
　　2.TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　石蠟切片，經(jīng)TUNEL染色

8、后，檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡情況。
　　3.免疫熒光化學(xué)檢測(cè)
　　取石蠟切片，進(jìn)行GRP78（santa Cruz公司，美國）和caspase12(santa Cruz公司，美國)免疫熒光化學(xué)檢測(cè)。
　　4.免疫組織化學(xué)染色
　　石蠟切片，進(jìn)行IL-1β（美國Santa Cruz公司）和VCAM-1（英國abcam公司）免疫組織化學(xué)染色。
　　5.免疫印跡法(Western blot)
　　取左心室組織，提

9、取膜蛋白應(yīng)用免疫印跡法檢測(cè)ACE2基因轉(zhuǎn)染后ACE2蛋白表達(dá)情況。提取總蛋白檢測(cè)CHOP、P-JNK、T-JNK蛋白的表達(dá)。
　　[研究結(jié)果]:
　　1.實(shí)驗(yàn)進(jìn)展情況
　　實(shí)驗(yàn)過程中，正常對(duì)照組大鼠狀態(tài)良好，無死亡。糖尿病心肌病組大鼠出現(xiàn)多食、多飲、多尿和體重減輕及易激惹現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)過程中2只未達(dá)到DCM標(biāo)準(zhǔn)，1只大鼠死亡，總共61只大鼠完成實(shí)驗(yàn)，正常對(duì)照組12只，ACE2組16只，EGFP組17只，DCM組16只。

10、r>　　2.TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　行TUNEL染色，正常組心肌細(xì)胞少見凋亡細(xì)胞。ACE2組可見凋亡心肌細(xì)胞，但比DCM組和EGFP組顯著減少(P＜0.01)。DCM組和EGFP組與正常組相比心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多(P＜0.01)。
　　3.免疫熒光化學(xué)檢測(cè)
　　應(yīng)用免疫熒光化學(xué)技術(shù)檢測(cè)大鼠心肌組織中GRP78和caspase12蛋白的表達(dá)水平。ACE2組心肌組織可見少量、分布稀疏的GRP78和caspase

11、12蛋白。DCM和EGPF組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見分布濃密的GRP78和caspase12蛋白。ACE2組與DCM組和EGFP組相比GRP78表達(dá)明顯減少(P＜0.01);caspase-12在ACE2組的表達(dá)與DCM組和EGFP組相比也顯著降低(P＜0.01)。
　　4.免疫組織化學(xué)染色
　　應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)大鼠心肌組織中IL-1β和VCAM-1蛋白的表達(dá)水平。ACE2組心肌組織可見稀疏分布的IL-1β和VCAM-1蛋

12、白。DCM和EGPF組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見濃密分布的IL-1和VCAM-1蛋白。與DCM組和EGFP組相比，ACE2組IL-1β的表達(dá)明顯減少(P＜0.01);VCAM-1在ACE2組的表達(dá)與DCM組和EGFP組相比也顯著降低(P＜0.01)。
　　5.免疫印跡法(Western blot)
　　ACE2蛋白表達(dá):ACE2組ACE2蛋白的表達(dá)明顯高于DCM組和EGFP組(P＜0.01);DCM組與EGFP組ACE2蛋白表達(dá)差異

13、無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　CHOP、P-JNK蛋白的表達(dá):ACE2組CHOP、P-JNK蛋白的表達(dá)明顯低于DCM組和EGFP組(P＜0.01);DCM組與EGFP組CHOP、P-JNK蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　6.心肌AngⅡ檢測(cè)
　　應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠心肌組織中AngⅡ含量。心肌AngⅡ含量在ACE2組較DCM組和EGFP組明顯減少(P＜0.05);DCM組和EGFP組心肌A

14、ngⅡ含量與正常組相比明顯升高(P＜0.01)。
　　7.心功能檢測(cè)指標(biāo)
　　檢測(cè)的心功能指標(biāo)包括:左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)，射血分?jǐn)?shù)(EF)，左心室縮短分?jǐn)?shù)(FS)。實(shí)驗(yàn)?zāi)?，與DCM組和EGFP組相比ACE2組心功能各項(xiàng)指標(biāo)均有好轉(zhuǎn)(P＜0.05)。
　　8.大鼠血糖測(cè)定
　　注射STZ之前，各組大鼠間血糖無明顯差異(P＞0.05)。注射STZ7天后，各組大鼠間空腹血糖，EG

15、FP組和DCM組及ACE2組較正常組明顯升高(P＜0.01)。
　　[研究結(jié)論]:
　　1.通過腹腔注射STZ并喂養(yǎng)3個(gè)月，成功建立了DCM大鼠模型，為本實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　2.GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)記分子，在DCM大鼠心肌組織中表達(dá)增多，說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在DCM的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
　　3.行TUNEL染色顯示DCM大鼠心肌組織中凋亡細(xì)胞明顯增多，提示心肌細(xì)胞凋亡參與了DCM的進(jìn)展。