內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)自吞噬對(duì)脂多糖誘導(dǎo)HL-1心肌細(xì)胞損傷保護(hù)機(jī)制的研究.pdf

1、膿毒血癥是以多器官功能衰竭和心血管抑制為特征的全身炎性反應(yīng)綜合癥,臨床研究證明心臟功能抑制顯著增加膿毒血癥病人的死亡率。在細(xì)胞水平的研究發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡和能量代謝障礙是膿毒血癥中心血管功能衰竭的重要機(jī)制。
　　在膿毒血癥心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了自吞噬體增加、線粒體損傷以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的現(xiàn)象,并且有研究發(fā)現(xiàn)這三者之間存在互為因果的關(guān)系。自吞噬是真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)化過(guò)程高保守的分解代謝過(guò)程,包括降解長(zhǎng)壽蛋白和清除老化受損細(xì)胞器,最終的降解產(chǎn)物參與新的

2、能量代謝。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),自吞噬選擇性地清除受損的線粒體有利于細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持,促進(jìn)應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞存活。線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量代謝的主要場(chǎng)所,并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡途徑的調(diào)節(jié)。線粒體的質(zhì)量控制依賴受損/老化線粒體的修復(fù)/清除和線粒體生物合成之間的動(dòng)態(tài)平衡,但是在膿毒血癥心肌細(xì)胞中自吞噬對(duì)線粒體再生的影響還需進(jìn)一步的研究。雖然很多研究已經(jīng)證明未內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的適應(yīng)性未折疊蛋白反應(yīng)參與了自吞噬的發(fā)生,但這個(gè)觀點(diǎn)在膿毒血癥心肌細(xì)胞中未見(jiàn)報(bào)道。
　　

3、通過(guò)建立 HL-1心肌細(xì)胞膿毒血癥模型,研究自吞噬的表達(dá)、發(fā)生和自吞噬抗細(xì)胞凋亡的保護(hù)機(jī)制,為膿毒血癥心臟功能衰竭提供臨床治療靶點(diǎn)。
　　本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 脂多糖誘導(dǎo)自吞噬對(duì) HL-1心肌細(xì)胞凋亡的影響
　　目的:研究脂多糖誘導(dǎo) HL-1心肌細(xì)胞自吞噬表達(dá)及自吞噬對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　方法:建立 HL-1心肌細(xì)胞膿毒癥模型,脂多糖以1ug/ml終濃度干預(yù) HL-1心肌細(xì)胞。應(yīng)用

4、蛋白免疫印跡方法觀察脂多糖干預(yù) HL-1心肌細(xì)胞2、4、8、16、24h的LC3II蛋白的表達(dá)時(shí)程;在脂多糖干預(yù)4和24h,通過(guò)透射電子顯微鏡和共聚焦顯微鏡觀察自吞噬體的形成,實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè) ATG5和ATG7mRNA的表達(dá)評(píng)估自吞噬活性,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。3-甲基嘌呤(3-MA)和納巴霉素(Rap)預(yù)處理48h后,分別觀察脂多糖干預(yù)4和24h心肌細(xì)胞凋亡和LC3II蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:脂多糖干預(yù) HL-1心

5、肌細(xì)胞2h后 LC3II開(kāi)始上調(diào),4h達(dá)到高峰,24h減弱;共聚焦顯微鏡顯示,脂多糖干預(yù)4h后出現(xiàn)綠色熒光斑點(diǎn)物質(zhì)出現(xiàn)聚集,24h減弱;電子顯微鏡顯示在脂多糖干預(yù)4h,出現(xiàn)了雙膜或多膜結(jié)構(gòu)的自吞噬體,而在24h減少。ATG5和ATG7mRNA表達(dá)在脂多糖干預(yù)后4h上調(diào),同樣在24h下降。3-MA預(yù)處理后,誘導(dǎo)了脂多糖干預(yù)4h的細(xì)胞凋亡。Rap預(yù)處理后,抑制了脂多糖在24h誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論:脂多糖在 HL-1心肌細(xì)胞誘導(dǎo)了

6、自吞噬,表現(xiàn)為早期增強(qiáng),而晚期表現(xiàn)為下降。自吞噬在膿毒癥中表現(xiàn)為細(xì)胞保護(hù)作用。
　　第二部分 脂多糖誘導(dǎo)自吞噬對(duì) HL-1心肌細(xì)胞線粒體功能影響的研究
　　目的:研究膿毒血癥心肌細(xì)胞中自吞噬線粒體功能和線粒體再生的影響。
　　方法:建立HL-1心肌細(xì)胞內(nèi)毒素血癥模型。在脂多糖干預(yù)24h后,通過(guò)電子顯微鏡、流式細(xì)胞儀和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)觀察線粒體面積和光密度,線粒體膜電位,線粒體再生基因 Tfam和PGC-1a的變

7、化評(píng)估線粒體功能。脂多糖干預(yù)前,3-甲基嘌呤(3-MA)和納巴霉素(Rap)預(yù)處理48h,觀察線粒體功能及線粒體再生的變化。
　　結(jié)果:HL-1心肌細(xì)胞在脂多糖干預(yù)24h后,線粒體面積和光密度增加,線粒體膜電位下降,并伴隨線粒體再生基因 Tfam和PGC-1amRNA表達(dá)下調(diào)。3-MA預(yù)處理下調(diào)自吞噬的表達(dá),加重了脂多糖對(duì)線粒體功能的損傷和進(jìn)一步抑制了線粒體再生基因的表達(dá)。納巴霉素預(yù)處理,上調(diào)自吞噬的表達(dá),減輕了脂多糖對(duì)線粒體功能

8、的損傷,同時(shí)線粒體再生功能上調(diào)。
　　結(jié)論:脂多糖在 HL-1心肌細(xì)胞導(dǎo)致了線粒體超微結(jié)構(gòu)的損傷和線粒體膜電位下降,抑制了線粒體的再生功能。抑制自吞噬,加重了脂多糖對(duì)線粒體的損傷,上調(diào)自吞噬,減輕了脂多糖對(duì)線粒體功能的損傷。自吞噬在 HL-1心肌細(xì)胞內(nèi)毒素血癥中對(duì)線粒體功能起到保護(hù)作用。
　　第三部分 脂多糖在 HL-1心肌細(xì)胞誘導(dǎo)自吞噬發(fā)生機(jī)制的研究
　　目的:研究在 HL-1心肌細(xì)胞中脂多糖是否通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)自

9、吞噬。
　　方法:建立HL-1心肌細(xì)胞脂多糖內(nèi)毒血癥模型。通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)脂多糖干預(yù)4、24h和對(duì)照組 GRP78和IRE1amRNA表達(dá),觀察脂多糖誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的變化。衣霉素(Tm)和?；敲撗跄懰?TUDCA)預(yù)處理后,通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)、蛋白免疫印跡和共聚焦顯微鏡觀察脂多糖干預(yù) HL-1心肌細(xì)胞4h后,GRP78、IRE1a、ATG5和ATG7mRNA,LC3II蛋白印跡和綠色 LC3II熒光顆粒的表達(dá)評(píng)估

10、的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自吞噬變化的關(guān)系。
　　結(jié)果:脂多糖在 HL-1心肌細(xì)胞中誘導(dǎo)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,與對(duì)照組比較, GRP78和IRE1amRNA在干預(yù)后4h表達(dá)上調(diào),24h表達(dá)下降。與對(duì)照組比較,衣霉素誘導(dǎo)了GRP78和IRE1amRNA、LC3II蛋白印跡和綠色 LC3II熒光表達(dá)顆粒上調(diào);與脂多糖干預(yù)4h組比較,衣霉素增強(qiáng)了脂多糖誘導(dǎo)的GRP78和IRE1a的表達(dá),同時(shí)進(jìn)一步增加了LC3II蛋白印跡和綠色 LC3II熒光顆粒的表達(dá)。牛