肝再生增強(qiáng)因子在細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激損傷中的作用研究.pdf

1、第一部分：下調(diào)肝再生增強(qiáng)因子對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激損傷的影響
　　目的：觀察ALR是否參與了細(xì)胞氧化應(yīng)激的病理過(guò)程，并探究下調(diào)ALR表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激損傷的影響。
　　方法：采用H2O2誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot檢測(cè)細(xì)胞ALR表達(dá)情況。設(shè)計(jì)特異性小干擾RNA（siRNA）下調(diào)HK-2細(xì)胞ALR表達(dá)，以siRNA/control對(duì)照組，實(shí)

2、時(shí)熒光定量PCR、Western blot及免疫熒光驗(yàn)證ALR干擾效果，MTS檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。H2O2刺激12h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞活性氧（ROS）水平、線粒體膜電位變化及細(xì)胞凋亡情況；Western blot檢測(cè)凋亡蛋白Bcl-2/Bax表達(dá)水平及線粒體蛋白（Cyt C、Smac）釋放；激光共聚焦檢測(cè)Cyt C釋放。
　　結(jié)果：實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot檢測(cè)顯示，與siRNA/control對(duì)照組比較，H2

3、O2刺激組細(xì)胞內(nèi)源性23kDALR mRNA及蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)。MTS結(jié)果顯示，下調(diào)23kD ALR表達(dá)對(duì)HK-2細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響(P>0.05)，但加重了H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。與siRNA/control組相比，細(xì)胞ROS水平顯著增加，膜電位降低細(xì)胞比例明顯增加，促進(jìn)了H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)及線粒體凋亡相關(guān)蛋白釋放，增加了H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)

4、論：23kD ALR參與了H2O2誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。下調(diào)23kD ALR表達(dá)可加重H2O2誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激損傷。
　　第二部分：23kD肝再生增強(qiáng)因子表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及功能研究
　　目的：探究過(guò)表達(dá)23kD肝再生增強(qiáng)因子對(duì)人正常肝細(xì)胞（L-02）增殖及凋亡的影響。
　　方法：構(gòu)建23kD ALR重組表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA6/23kDALR。以MegaTran1.0轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至L-02細(xì)胞，實(shí)時(shí)

5、熒光定量PCR及Western blot檢測(cè)細(xì)胞ALR mRNA及蛋白水平表達(dá)情況，MTS檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡變化。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建pcDNA6/23kDALR表達(dá)質(zhì)粒。實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot檢測(cè)顯示，與空質(zhì)粒對(duì)照組比較，L-02細(xì)胞過(guò)表達(dá)組23kD ALR表達(dá)顯著增加（ P<0.01）;與空質(zhì)粒對(duì)照組相比， pcDNA6/23kD ALR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h及72h細(xì)胞增殖顯