自噬—溶酶體途徑在氧化應(yīng)激時(shí)對(duì)SPCA1活性影響.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、研究背景及目的:
  急性腦缺血后會(huì)引發(fā)一系列的損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng),包括鈣穩(wěn)態(tài)失衡、興奮性氨基酸的毒性作用、氧化應(yīng)激損傷、線粒體功能障礙等,以及隨之產(chǎn)生的蛋白酶激活、基因表達(dá)的改變,最終導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡。大量研究表明,氧化應(yīng)激損傷在腦缺血后神經(jīng)元損傷中起到了關(guān)鍵作用。氧化應(yīng)激時(shí)自由基的大量生成導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載,細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加能激活凋亡,使細(xì)胞產(chǎn)生不可逆的細(xì)胞的損傷。氧化應(yīng)激時(shí)可激活自噬溶酶體途徑,細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)量增加

2、。自噬體吞噬細(xì)胞內(nèi)受損的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng),并能控制線粒體的數(shù)量和質(zhì)量。對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)的鈣超載,有細(xì)胞保護(hù)作用。但是缺血再灌注時(shí)高爾基體鈣泵SPCA1對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣超載的應(yīng)答、自噬對(duì)SPCA1的功能影響方面的研究鮮有人涉及。本實(shí)驗(yàn)將從神經(jīng)元受到缺血再灌注損傷時(shí)自噬的是否激活、激活的自噬對(duì)高爾基體的SPCA1的影響方面探討自噬對(duì)高爾基體的影響。尋求減少氧化應(yīng)激損傷的新途徑。
  方法:
  1.建立氧化應(yīng)激模型:選擇不同濃度的H2O2作用

3、于N2a細(xì)胞,以MTT法檢測(cè)不同濃度的H2O2對(duì)N2a細(xì)胞活性的影響;
  2.實(shí)驗(yàn)分為正常組H2O2處理組和3-MA預(yù)處理組;H2O2處理組和3-MA預(yù)處理組H2O2的濃度分別為20μM、50μM、80μM;
  3.H2O2處理后MDC染色檢測(cè)自噬的活性變化;
  4.Fura-2/am檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化;
  5.RT-PCR檢測(cè)各組SPCA1mRNA表達(dá)變化;
  6.Western

4、blot檢測(cè)3-MA預(yù)處理前后,模型高爾基體蛋白SPCA1及自噬標(biāo)記物L(fēng)C3B表達(dá)變化。
  實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
  1.MTT結(jié)果顯示隨著Ca2+濃度的增加,細(xì)胞損傷逐漸加重,H2O2對(duì)細(xì)胞的損害具有濃度依賴性,MDC染色觀察自噬數(shù)目發(fā)現(xiàn),自噬顆粒也隨著H2O2濃度的增加而增加。LC3B的western blot結(jié)果也表明自噬活性隨H2O2濃度的增加而增加(P<0.05),同時(shí)證明自噬抑制劑3-MA可有效抑制自噬活性。
  

5、2.細(xì)胞經(jīng)H2O2處理后,F(xiàn)ura-2/am檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度較正常組明顯增加(P<0.05),除20μM濃度時(shí)H2O2處理組和3-MA預(yù)處理組的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化不明顯外(P>0.05),其余各組3-MA預(yù)處理組均較H2O2處理組的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度較H2O2組增加更顯著(P<0.05)。
  3.與正常組比較,H2O2處理組SPCA1mRNA和SPCA1蛋白表達(dá)明顯較少(P<0.05),3-MA預(yù)處理組SPCA1mR

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