硫化氫在芥子氣致肺氧化應激損傷中的作用及機制研究.pdf

1、芥子氣（sulfur mustard，SM）是糜爛性毒劑的典型代表，多次在各種沖突中使用，造成重大傷亡，也一直是我軍面臨的化學戰(zhàn)劑威脅之一。芥子氣結構簡單，難防難治，易于合成，容易被恐怖分子掌握和利用，是最有可能被用于恐怖襲擊的毒劑之一，也是中國面臨的化學恐怖威脅之一。因此，積極探索芥子氣中毒機制，開發(fā)有效的防治藥物，對我軍戰(zhàn)斗力的保持、國家公共安全和中國公民健康都具有重大的戰(zhàn)略意義。
　　肺是芥子氣損傷的主要靶器官，急性肺損傷是

2、芥子氣致死的主要原因之一，而氧化應激是芥子氣肺損傷的起始和關鍵環(huán)節(jié)之一。硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)作為一種新型氣體信號分子，廣泛參與機體的多種生理和病理過程，具有明確的抗氧化作用。H2S可以通過抑制ROS的產(chǎn)生，促進GSH合成，促進Nrf2核轉(zhuǎn)位等途徑改善肺纖維化，肺缺血再灌注損傷和急性肺損傷。H2S對于肺部正常生理功能的維持具有重要的作用。
　　本文研究發(fā)現(xiàn)，H2S在動物和細胞水平上都參與了芥子氣致肺損傷

3、的調(diào)節(jié)過程，可改善芥子氣引起的肺氧化應激損傷;進一步研究發(fā)現(xiàn)，H2S可通過硫巰基化Keap1使Nrf2解離，促進Nrf2入核表達，在芥子氣致肺損傷中發(fā)揮抗氧化應激調(diào)節(jié)作用。
　　一、H2S對芥子氣染毒小鼠肺部損傷的作用及機制研究
　　芥子氣染毒后，采用比率計H2S熒光探針RHP-2檢測不同時間點肺組織中H2S的含量變化，結果發(fā)現(xiàn)，染毒后第1天開始肺組織中H2S含量開始下降，第3天與對照組有明顯差異(P＜0.01）。蛋白印跡法

4、檢測肺組織中H2S合成酶CBS和CSE的表達，芥子氣染毒后第1天到第4天，小鼠肺組織中CBS沒有明顯變化，而CSE表達降低，第3天與對照組相比有明顯差異(P＜0.01）。
　　進一步考察了內(nèi)源性H2S含量變化與芥子氣致小鼠肺損傷的關系，芥子氣染毒小鼠給予H2S供體化合物NaHS后可升高內(nèi)源性H2S含量，給予H2S合成酶抑制劑PPG則可降低內(nèi)源性H2S含量。通過染毒后第3天小鼠肺組織HE染色的病理切片發(fā)現(xiàn)，芥子氣染毒小鼠肺組織中肺泡

5、壁增厚，間質(zhì)及肺泡腔出血，炎性細胞浸潤;NaHS可以改善芥子氣造成的肺損傷，PPG則會加重損傷。另外，NaHS可以降低肺濕/干重比和肺泡灌洗液中的蛋白濃度，顯著改善肺損傷。
　　也對小鼠肺組織氧化應激損傷情況做了分析。芥子氣染毒后，SM組小鼠肺組織中的H2O2、MDA含量顯著升高;與SM相比，SM+NaHS組H2O2、MDA含量顯著降低，SM+PPG組H2O2、MDA含量顯著升高。同時，SM組小鼠肺組織中的GSH/GSSG、SOD

6、活性顯著降低，SM+NaHS組與SM相比，GSH/GSSG、SOD活性顯著升高;SM+PPG組GSH/GSSG、SOD活性顯著降低。
　　進一步考查了Keap1-Nrf2通路上的Nrf2、HO-1和NQO1等相關蛋白表達和下游GR、GCLC和GCLM等相關基因表達，初步探討了H2S在芥子氣致小鼠肺損傷中發(fā)揮作用的可能機制。結果顯示，染毒小鼠給予NaHS可促進Nrf2入核表達，升高Nrf2下游相關抗氧化基因HO-1、NQO1、GCL

7、C、GR、GCLM和抗氧化蛋白HO-1、NQO1表達，從而減輕氧化應激損傷;給予PPG會出現(xiàn)相反的結果。這提示Nrf2可能在H2S調(diào)節(jié)SM致肺損傷的過程發(fā)揮重要作用。
　　二、H2S對芥子氣染毒BEAS-2B細胞和MRC-5細胞的保護作用及機制研究
　　進一步在細胞水平上驗證了H2S對芥子氣損傷的保護作用和機制。應用CCK-8法檢測不同濃度芥子氣對人支氣管上皮細胞BEAS-2B和人肺成纖維細胞MRC-5毒性作用，給予不同濃度

8、的NaHS，結果顯示當NaHS濃度為70μM時可顯著升高芥子氣染毒細胞活力。通過NIR-HS熒光探針孵育細胞后共聚焦顯微鏡下觀察熒光強度，進一步研究內(nèi)源性H2S含量變化，同時檢測細胞內(nèi)ROS分析氧化應激損傷狀態(tài)，觀察發(fā)現(xiàn)，給予NaHS組與芥子氣組相比，細胞熒光強度即內(nèi)源性H2S含量升高，細胞內(nèi)ROS含量明顯降低。應用基因沉默技術，敲低CSE表達后的細胞熒光強度即內(nèi)源性H2S含量低于普通細胞，細胞內(nèi)ROS含量升高。敲低CSE后給予NaHS

9、的細胞內(nèi)NaHS升高H2S含量的作用被阻斷，且細胞內(nèi)ROS含量明顯升高。結果表明，NaHS可通過CSE升高內(nèi)源性H2S含量，并改善細胞內(nèi)氧化應激損傷。
　　細胞水平上研究Nrf2在H2S調(diào)節(jié)SM致?lián)p傷中的作用。普通細胞中，與SM處理組相比，SM+NaHS組胞核中Nrf2表達顯著升高，Nrf2下游的HO-1和NQO1表達明顯升高，細胞內(nèi)ROS含量降低。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染沉默Nrf2基因表達細胞中，SM+NaHS組與普通細胞中的SM+NaHS組

10、相比，胞漿和胞核中的Nrf2表達均顯著降低，Nrf2下游的HO-1和NQO1表達顯著降低，細胞內(nèi)ROS含量升高。結果表明，基因沉默Nrf2后，與普通細胞中的SM+NaHS組相比，NaHS在芥子氣染毒細胞中的作用被阻斷。進一步檢測細胞中S-硫巰基化Keap1蛋白表達，發(fā)現(xiàn)SM組同對照組相比，S-硫巰基化Keap1蛋白表達降低;SM+NaHS組與SM組相比，S-硫巰基化Keap1蛋白表達顯著升高，細胞中應用硫巰基化抑制劑DTT后，SM+Na

11、HS+DTT組與SM+NaHS組相比，S-硫巰基化Keap1蛋白表達顯著降低，且胞核中Nrf2表達降低。結果表明，芥子氣損傷細胞中硫巰基化抑制劑DTT可以阻斷NaHS的保護作用，H2S通過硫巰基化Keap1促進Nrf2核轉(zhuǎn)錄，在芥子氣損傷中發(fā)揮抗氧化應激作用。
　　本實驗研究中發(fā)現(xiàn)，芥子氣致肺氧化應激損傷中內(nèi)源性H2S含量降低，通過給予芥子氣染毒小鼠H2S供體化合物NaHS，可升高內(nèi)源性H2S含量，促進Nrf2入核表達，升高Nrf