Nrf2在大鼠HSC氧化應(yīng)激損傷中的作用及機(jī)制.pdf

1、背景
　　非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD）是指一種肝組織學(xué)改變與酒精性肝病相似，但無過量飲酒史的臨床病理綜合征，其疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝(non-alcoholicfattyliver,NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholicsteatohepatitis,NASH）和肝硬化。NASH的組織病理學(xué)特征主要為肝細(xì)胞的損傷和脂肪變、肝臟的炎癥改變和

2、輕重程度不一的肝纖維化，是由單純性脂肪肝發(fā)展至肝纖維化及肝硬化的重要轉(zhuǎn)折點(diǎn)。近年來隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，NASH發(fā)病率呈明顯上升趨勢，但是NASH的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。目前比較成熟的“二次打擊”學(xué)說認(rèn)為氧化應(yīng)激損傷是肝臟發(fā)生脂肪變以及進(jìn)一步發(fā)展為NASH的重要因素。
　　肝星狀細(xì)胞（hepaticstellatecell,HSC）的活化和增殖被認(rèn)為是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)。生理狀態(tài)下HSC的主要功

3、能是儲(chǔ)存脂肪和維生素A。在各種因素刺激下，HSC被激活，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，具有增殖、分泌細(xì)胞因子、分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix,ECM）的特性。由于活化的HSC是肝臟ECM分泌的主要來源，因此HSC被認(rèn)為是預(yù)防和治療慢性肝病的重要靶細(xì)胞。
　　轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（NF-E2-relatedfactor2,Nrf2）是細(xì)胞防御氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，它可以與抗氧化反應(yīng)元件(antioxi

4、dant-responseelement,ARE)結(jié)合，上調(diào)抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力。最近研究認(rèn)為Nrf2是細(xì)胞抗氧化反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)者，Nrf2能夠維持細(xì)胞內(nèi)的氧化平衡，降低細(xì)胞對(duì)死亡信號(hào)的敏感性，在細(xì)胞抵御外源性或內(nèi)源性氧化應(yīng)激的機(jī)制中發(fā)揮重要作用。但目前關(guān)于Nrf2的研究多集中在神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等領(lǐng)域，Nrf2在HSC氧化應(yīng)激損傷中的作用及機(jī)制尚未見報(bào)道。
　　本實(shí)驗(yàn)以大鼠HSC-T6為研究對(duì)象，制

5、備氧化應(yīng)激的細(xì)胞模型，研究HSC內(nèi)Nrf2表達(dá)以及觀察氧化應(yīng)激對(duì)其表達(dá)的影響，并上調(diào)HSC內(nèi)Nrf2核轉(zhuǎn)位水平，觀察Nrf2對(duì)HSC氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。
　　目的
　　本實(shí)驗(yàn)采用葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase,GO）制備大鼠HSC-T6的氧化應(yīng)激模型，觀察氧化應(yīng)激對(duì)HSC中Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響，研究能否通過姜黃素促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位而改善HSC的氧化應(yīng)激損傷及纖維化狀態(tài)，為以Nrf2為靶點(diǎn)進(jìn)行NASH的防治提供

6、新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　方法
　　1.將HSC-T6分成陰性對(duì)照組和氧化應(yīng)激組。陰性對(duì)照組：正常培養(yǎng)未給予任何干預(yù)；氧化應(yīng)激組：僅加入100U/LGO干預(yù)2h，制備氧化應(yīng)激細(xì)胞模型。Westernblot法和細(xì)胞免疫化學(xué)法觀察Nrf2表達(dá)的變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（reactiveoxygenspecies,ROS）水平的變化，分光光度法檢測丙二醛（malondialdehyde,MDA）、谷胱甘肽（glut

7、athione,GSH）水平。
　　2.將大鼠HSC-T6分成陰性對(duì)照組、氧化應(yīng)激組和姜黃素干預(yù)組三組。陰性對(duì)照組、氧化應(yīng)激組按照方法1造模，姜黃素干預(yù)組先加入30μmol/L姜黃素干預(yù)3h，再給予100U/LGO干預(yù)2h。用細(xì)胞免疫化學(xué)法和Westernblot法觀察Nrf2的表達(dá)，間接免疫熒光法觀察HSC的活化水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平，分光光度法檢測MDA、GSH水平，放射免疫法檢測ECM的分泌水平。
　　結(jié)

8、果
　　1.本實(shí)驗(yàn)用GO法成功建立大鼠HSC-T6的氧化應(yīng)激模型，氧化應(yīng)激組ROS及MDA水平較陰性對(duì)照組顯著升高（P<0.01）。
　　2.Westernblot的結(jié)果顯示氧化應(yīng)激組與陰性對(duì)照組Nrf2總蛋白表達(dá)未見明顯差異，而陰性對(duì)照組Nrf2核蛋白未見明顯表達(dá)，氧化應(yīng)激組Nrf2核蛋白表達(dá)明顯增加；細(xì)胞免疫化學(xué)染色結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組Nrf2蛋白的陽性表達(dá)僅見于胞漿，胞核內(nèi)未見Nrf2蛋白明顯表達(dá)，而氧化應(yīng)激組Nrf2

9、蛋白在胞漿和胞核中均可見陽性表達(dá)；分光光度法結(jié)果顯示氧化應(yīng)激組GSH水平較陰性對(duì)照組明顯增加（P<0.01）。
　　3.姜黃素干預(yù)組與氧化應(yīng)激組、陰性對(duì)照組相比較，WesternBlot結(jié)果顯示各組中Nrf2總蛋白的表達(dá)未見明顯變化，氧化應(yīng)激組中Nrf2胞漿蛋白的表達(dá)較陰性對(duì)照組有所下降，姜黃素干預(yù)組中Nrf2胞漿蛋白的表達(dá)較氧化應(yīng)激組下降明顯。細(xì)胞免疫化學(xué)染色的結(jié)果同樣顯示各組中Nrf2的總體表達(dá)未見明顯差異，陰性對(duì)照組中棕色顆

10、粒均集中在胞漿中，胞核內(nèi)未見陽性表達(dá)；氧化應(yīng)激組中棕色顆粒的表達(dá)大多在胞漿中，胞核內(nèi)也有少量表達(dá)；姜黃素干預(yù)組中棕色顆粒的表達(dá)大多集中在胞核內(nèi)，胞漿中的表達(dá)明顯下降。
　　4.間接免疫熒光法結(jié)果顯示，Desmin在各組細(xì)胞中均呈陽性表達(dá)，但是在陰性對(duì)照組中α-SMA未見陽性表達(dá)，氧化應(yīng)激組中α-SMA的陽性表達(dá)明顯增加，姜黃素干預(yù)組中α-SMA可見少量表達(dá)。
　　5.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激組的DHE熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，陰性對(duì)

11、照組的DHE熒光強(qiáng)度最弱，姜黃素干預(yù)組的DHE熒光強(qiáng)度居中（P<0.01）。分光光度法結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激組中MDA水平較陰性對(duì)照組明顯增高（P<0.01），姜黃素干預(yù)組中MDA水平較氧化應(yīng)激組顯著降低（P<0.01）但仍高于陰性對(duì)照組；與陰性對(duì)照組相比，氧化應(yīng)激組中GSH水平有所提高（P<0.01），而姜黃素干預(yù)組中GSH水平升高明顯（P<0.01）。
　　6.放射免疫法結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激后培養(yǎng)基中Ⅲ型前膠原蛋白（type-Ⅲpr

12、ocollagen,PCⅢ）、Ⅳ型膠原蛋白(type-Ⅳcollagencollagen,CⅣ)、層粘連蛋白（laminin,LN）和透明質(zhì)酸(hyaluronicacid,HA)的分泌明顯增加（P<0.01），姜黃素干預(yù)組中PCⅢ、CⅣ、LN和HA的表達(dá)較氧化應(yīng)激組有所下降（P<0.01），但仍高于陰性對(duì)照組。
　　結(jié)論
　　本實(shí)驗(yàn)成功制備了大鼠HSC的氧化應(yīng)激細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激條件下HSC內(nèi)Nrf2發(fā)生核轉(zhuǎn)位并發(fā)揮其