LncRNA MALAT1與microRNA181b調(diào)控缺血性腦卒中后血管新生的初步研究.pdf

1、為明確lncRNA MALAT1與miRNA181b的相關(guān)性，采用計(jì)算機(jī)生物學(xué)軟件通過“堿基互補(bǔ)的原則”進(jìn)行位點(diǎn)的預(yù)測，將預(yù)測出的位點(diǎn)克隆至雙熒光素酶報(bào)告基因進(jìn)一步驗(yàn)證;位點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)證確認(rèn)后則進(jìn)一步研究兩者表達(dá)的相關(guān)性。此外，miRNA181b可與(葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白)GRP78的靶基因mRNA-3'UTR結(jié)合從而調(diào)節(jié)GRP78的表達(dá)，通過改變lncRNA MALAT1與miRNA181b的濃度檢測GRP78的表達(dá)水平，明確兩者的調(diào)控關(guān)系。否則

2、調(diào)整實(shí)驗(yàn)方向。目前研究血管新生的細(xì)胞主要有人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)及微血管內(nèi)皮細(xì)胞(MVEC)，本實(shí)驗(yàn)選擇的是小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(bEnd3)，主要原因是:細(xì)胞培養(yǎng)簡單，對培養(yǎng)基無特殊要求;其增值迅速，對血管因子敏感;來源小鼠，離體和在體實(shí)驗(yàn)相銜接。大量研究證明:缺血性腦卒中后VEGF、TNF-α、ANG-Ⅰ等因子大量增加，并促進(jìn)了血管新生;因此，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)使用一種或多種缺血性腦卒中后的因子，模擬腦卒中后高濃度因子環(huán)境，刺激目標(biāo)細(xì)

3、胞，在觀察細(xì)胞增殖遷移的基礎(chǔ)上檢測lncRNA MALAT1及miRNA181b的表達(dá)，同時(shí)利用氧-糖剝奪(oxygen-glucose Deprivation，OGD)致目標(biāo)細(xì)胞的缺血模型，檢測二者的表達(dá)變化;最后通過改變二者表達(dá)水平刺激目標(biāo)細(xì)胞，檢測細(xì)胞的增殖、遷移、相關(guān)促血管生成因子的變化。在促血管生成因子的研究中，VEGF研究最為透徹，其家族成員VEGFA與血管新生最為緊密。VEGFA與VEGFR2結(jié)合激活兩條信號通路:激活Sr

4、c信號通路后，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞上α6β1整合素與其配體分離，進(jìn)一步激活金屬基質(zhì)蛋白酶（MMPs，主要是MMP2、MMP9），降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移;其次，激活經(jīng)典的PI3/AKT信號通路，釋放鈣離子、PKC等第二信使促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞活化、分裂、增殖，促進(jìn)血管新生。其中AKT、P-AKT則是PI3/AKT信號通路的核心蛋白。
　　由于實(shí)驗(yàn)檢測目標(biāo)中包括了VEGF，因此VEGF不能作為刺激因子;此外，ANG-Ⅰ必須與其受體結(jié)合才能

5、發(fā)揮作用，但其受體只存在于受損的內(nèi)皮細(xì)胞表面。目前相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道使用TNF-α刺激HUVEC觀察細(xì)胞增殖遷移及miRNA表達(dá)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件及實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)，實(shí)驗(yàn)選擇TNF-α作為刺激因子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測指標(biāo)及方法如下:血管新生:細(xì)胞增殖(MTT法)、細(xì)胞遷移（Transwell法）;過表達(dá)miRNA181b(miRNA181b mimics)、抑制miRNA181b(miRNA181b inhibitor);過表達(dá)lncRNA MALA

6、T1（質(zhì)粒）、抑制lncRNA MALAT1（siRNA或siMALAT1）;q-PCR檢測VEGFA、MMP2、MMP9;免疫印跡法檢測VEGF、AKT/P-AKT、GRP78。
　　第一部分 LncRNA MALAT1與miRNA181b位點(diǎn)的預(yù)測及表達(dá)水平相關(guān)性的檢測
　　研究目的:明確lncRNA MALAT1、miRNA181b之間是否存在結(jié)合位點(diǎn)及兩者的調(diào)控關(guān)系。
　　研究方法:首先通過miRNA及l(fā)ncR

7、NA生物數(shù)據(jù)庫查找lncRNA MALAT1、miRNA181b的堿基序列;通過計(jì)算機(jī)生物軟件‘RNA22version2.0’預(yù)測lncRNAMALAT1、miRNA181b之間是否存在結(jié)合位點(diǎn);如果存在，則將預(yù)測出的位點(diǎn)克隆至雙熒光素酶報(bào)告基因進(jìn)一步確認(rèn)位點(diǎn)的可靠性。最后，通過miRNA181b mimics/inhibitor、siMALAT1轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測lncRNA MALAT1及miRNA181b、GRP78(HSPA5)的表

8、達(dá)水平，明確二者的調(diào)控關(guān)系。
　　研究結(jié)果:計(jì)算機(jī)預(yù)測小鼠lncRNA MALAT1與miRNA181b之間存在兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，位點(diǎn)最左側(cè)分別位于lncRNA MALAT1序列的2211、5124位置;雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)小鼠miRNA181b能夠降低該熒光素酶的表達(dá);miRNA181bmimics抑制lncRNA MALAT1、GRP78的表達(dá);miRNA181b inhibitor促進(jìn)lncRNAMALAT1、GRP7

9、8的表達(dá);siMALAT1促進(jìn)miRNA181b、抑制GRP78的表達(dá)。
　　研究結(jié)論:計(jì)算機(jī)生物學(xué)軟件預(yù)測得出小鼠lncRNA MALAT1與miRNA181b之間存在結(jié)合位點(diǎn)，經(jīng)驗(yàn)證位點(diǎn)可靠;lncRNA MALAT1與miRNA181b可以相互負(fù)向調(diào)控。
　　第二部分 低氧低糖條件下，lncRNA MALAT1與miRNA181b的表達(dá)變化及二者對細(xì)胞增殖遷移、VEGFA/MMP2/MMP9/VEGF/AKT/P-AK

10、T的調(diào)節(jié)
　　研究目的:TNF-α刺激和低氧低糖條件下lncRNA MALAT1與miRNA181b的表達(dá)變化及二者對細(xì)胞增殖遷移、VEGFA/MMP2/MMP9/VEGF/AKT/P-AKT的調(diào)節(jié)。
　　研究方法:首先不同濃度的TNF-α刺激bEnd3細(xì)胞，不同時(shí)間點(diǎn)檢測細(xì)胞的增值（MTT法）遷移（Transwell法）情況，摸索最佳的TNF-α刺激濃度。采用q-PCR檢測TNF-α刺激下lncRNA MALAT1、miR

11、NA181b的表達(dá)水平，同時(shí)利用OGD致目標(biāo)細(xì)胞缺血模型，檢測二者的表達(dá)水平;最后過表達(dá)/抑制miRNA181b及抑制lncRNA MALAT1表達(dá)檢測VEGFA、MMP2、MMP9、AKT、P-AKT的表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果:10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml濃度下對bEnd3細(xì)胞的增殖基本一致，各濃度刺激下的細(xì)胞增殖計(jì)數(shù)差異不明顯，但較對照組細(xì)胞增殖明顯(P＜0.001);細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)較其他時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖明顯

12、(P＜0.05)。TNF-α刺激bEnd3細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)后，促進(jìn)細(xì)胞增值遷移，同時(shí)促進(jìn)miRNA181b表達(dá)、抑制lncRNA MALAT1表達(dá)。bEnd3細(xì)胞完成24小時(shí)的OGD刺激后復(fù)氧復(fù)糖培養(yǎng)24小時(shí)，促進(jìn)miRNA181b表達(dá)，抑制lncRNA MALAT1表達(dá)。miRNA181b mimics/inhibitor轉(zhuǎn)染bEnd3后培養(yǎng)24小時(shí):mimics組促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移及VEGFA、MMP2、MMP9、VEGF、AKT

13、、P-AKT的表達(dá);inhibitor組抑制細(xì)胞增殖不明顯，但抑制細(xì)胞遷移及VEGFA、MMP2、MMP9、VEGF、AKT、P-AKT的表達(dá)。siMALAT1組促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移及VEGFA、MMP2、MMP9、VEGF、AKT、P-AKT的表達(dá)。
　　研究結(jié)論:缺血性腦卒中后，LncRNA MALAT1與miRNA181b結(jié)合而競爭性地調(diào)控miRNA181b的功能，同時(shí)miRNA181b也能夠負(fù)性調(diào)控lncRNA MALAT1