調控腦卒中后血管新生lncRNAs的發(fā)現(xiàn)及其功能的初步探討.pdf

1、研究背景和目的:
　　缺血性腦卒中是一種嚴重危害人類健康和生命安全的腦血管疾病,具有發(fā)病率高、致殘率高和死亡率高等特點,其治療的關鍵是及時、充分恢復腦缺血區(qū)的血供。臨床觀察發(fā)現(xiàn)腦卒中后可誘發(fā)缺血區(qū)反應性血管新生,而且腦組織微血管密度與卒中患者的預后存有密切關系。因此,進一步闡明腦卒中后血管新生的分子調控機制,尋找到有效的分子調控靶點,利用藥物或基因干預促進治療性血管新生有望根本改變目前腦卒中的治療現(xiàn)狀。
　　長鏈非編碼 RN

2、A(long non-coding RNAs)是一類由 RNA聚合酶 II轉錄的轉錄本長度超過200nt的長鏈非編碼 RNA,近年來,研究發(fā)現(xiàn) lncRNAs的表達具有組織特異性和發(fā)育特異性,某些 lncRNAs還與參與血管新生過程的多種基因和信號分子關系密切,但是腦卒中后 lncRNAs的表達變化如何,lncRNAs是否與其他非編碼 RNAs如 microRNAs等一樣參與腦卒中后的血管新生調控,目前尚不清楚。本研究通過 Solexa

3、高通量測序檢測大鼠腦缺血后腦組織 lncRNAs的表達譜變化,生物信息學分析腦卒中后差異表達的 lncRNAs,篩選出血管新生相關 lncRNAs,并初步探討腦缺血后血管新生相關 lncRNAs的功能及其可能的調控機制。
　　研究內容和方法:
　　1、體內實驗篩選腦卒中后血管新生相關 lncRNAs
　　(1)采用zea-longa法建立建立雄性 SD大鼠 MCAO模型,神經(jīng)功能評分、TTC染色及 MRI評估模型。

4、r>　　(2)采用 Solexa基因測序建立腦卒中后缺血腦組織 lncRNAs的表達譜, real-time PCR隨機驗證 lncRNAs的表達水平。
　　(3)生物信息學分析腦卒中后差異表達的 lncRNAs,篩選血管新生相關lncRNAs。
　　(4)采用 real-time PCR動態(tài)觀察腦卒中后所篩選出血管新生 lncRNAs MEG3的表達變化。
　　2、體外實驗分析所篩選的 lncRNA MEG3對血管新

5、生的調控功能
　　(1)原代人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)的分離培養(yǎng)與鑒定。
　　(2) HUVEC缺氧模型的建立:采用 real-time PCR檢測 HUVEC缺氧24h VEGFa的表達變化評估 HUVEC缺氧模型。
　　(3)缺氧對 MEG3和 VEGFa表達的影響:將正常培養(yǎng)的 HUVEC置于缺氧與常氧環(huán)境中培養(yǎng)12h、24h和48h,real-time PCR檢測 HUVEC缺氧后各個時間點 MEG3和

6、 VEGFa的表達變化。
　　(4)構建 pCDH-MEG3質粒并包裝 Lentiviral-meg3慢病毒。
　　(5)慢病毒感染過表達 HUVEC的 MEG3,real-time PCR驗證 MEG3的上調水平。
　　(6)MEG3過表達的 HUVEC血管生成能力的檢測:CCK-8法檢測 MEG3過表達 HUVEC的增殖能力,RTCA檢測 MEG3過表達 HUVEC的遷移能力, matrigel成管實驗檢測 MEG

7、3過表達 HUVEC的成管能力。
　　結果:
　　1、成功建立 SD大鼠 MCAO模型:MCAO大鼠均出現(xiàn)對側肢體偏癱、行走時原地轉圈和提尾向對側側身等神經(jīng)功能缺失表現(xiàn),神經(jīng)功能評分2分;TTC染色可見右側大腦中動脈供血區(qū)呈蒼白色而周圍正常腦組織呈現(xiàn)紅色;MRI結果顯示腦梗死 T1像及 DWI像呈高信號;缺血模型梗死灶一致性較好,可用于后續(xù)基因測序。
　　2、腦卒中后缺血腦組織 lncRNAs的表達譜發(fā)生顯著改變:腦缺

8、血后 Solexa基因測序共檢測出9287條 lncRNAs,與健側相比缺血側上調2倍以上及下調0.5倍且 P<0.05的 lncRNAs共448條,其中上調的 lncRNAs有414條,下調的lncRNAs34條;real-time PCR隨機驗證 lncR-14、lncR-30、lncR-4、lncR-40、lncR-64、lncR-65、lncR-76及 lncR-44的表達分別上調2.364±1.074倍、3.836±3.754

9、倍、1.643±1.095倍、5.544±4.774倍、2.504±1.749倍、2.206±1.416倍、1.572±1.095倍、2.389±1.305倍(P<0.05),lncR-41的表達下調0.5803±0.4459倍(P<0.05),與 Solexa高通量測序的結果趨勢一致,成功建立了腦缺血 lncRNAs的表達譜。
　　3、腦缺血后448條差異表達的 lncRNAs中,生物信息學篩選出47條與血管新生相關 lncRN

10、As,其中功能尚未注釋的 lncR41與血管新生相關,生物信息學分析 lncR41與小鼠 MEG3序列高度同源,提示 lncR41為大鼠 MEG3。
　　4、腦缺血后MEG3的表達下調:real-time PCR結果顯示腦缺血24h后MEG3的表達較健側下調0.784±0.124倍(P>0.05),腦缺血48h后 MEG3的表達較健側下調0.502±0.133倍(P<0.05),腦缺血72h后 MEG3的表達較健側下調0.723±

11、0.106倍(P<0.05)。
　　5、缺氧后 MEG3和 VEGFa表達發(fā)生變化:real-time PCR結果顯示缺氧后MEG3的表達呈先下降后上升的動態(tài)變化,即缺氧12h后 MEG3的表達下調0.3790±0.0187倍(P<0.05),24h后 MEG3的表達下調0.6618±0.0767(P>0.05),48h后 MEG3的表達上調3.7559±0.1915倍(P<0.05);缺氧后12h VEGFa的表達上調1.749

12、8±0.1916倍(P<0.05),24h后 VEGFa的表達上調2.3618±0.2725倍(P<0.05),48h后 VEGFa的表達上調2.7400±0.1761倍(P<0.05)。
　　6、成功構建出 pCDH-MEG3質粒并包裝出 Lentiviral-meg3慢病毒,病毒滴度>6x106/ml。
　　7、慢病毒感染過表達 MEG3抑制 HUVEC的增殖、遷移和成管等血管形成能力,抑制 HUVEC VEGFa和 n