Notch信號(hào)通路調(diào)控骨髓來源FSP-1+細(xì)胞參與腎間質(zhì)炎癥纖維化的研究.pdf

1、慢性腎臟病（Chronic Kidney Disease，CKD）的發(fā)病率及患病率呈逐年遞增的趨勢(shì)，已成為威脅公共健康的世界性難題。調(diào)查顯示，西方國(guó)家大約有8-10％人口受其影響，而我國(guó)CKD患者人數(shù)已超過1億，并且呈現(xiàn)出年輕化發(fā)病趨勢(shì)。腎纖維化是慢性腎臟病終末期的共同途徑和病理基礎(chǔ)，其病變嚴(yán)重程度和腎功能恢復(fù)密切相關(guān)。因此，深入剖析腎纖維化的發(fā)病機(jī)制，探索腎間質(zhì)纖維化的防治方法已成為腎臟病的研究熱點(diǎn)之一。
　　成纖維細(xì)胞特異性蛋

2、白-1（Fibroblast-specific protein1,FSP-1），也被稱為S100A4，是S100的鈣結(jié)合蛋白家族的一員，它從小鼠乳腺癌細(xì)胞中分離出來，亦可在骨髓、胸腺、脾臟和淋巴細(xì)胞的 mRNA中檢測(cè)到。FSP-1表達(dá)于腎臟、肺以及心臟等具有組織重塑能力器官的肌成纖維細(xì)胞，在正常機(jī)體微量表達(dá)或不表達(dá)，當(dāng)上皮細(xì)胞在病理狀態(tài)下往肌成纖維細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)變時(shí)FSP-1表達(dá)增強(qiáng)。故FSP-1已被普通認(rèn)為是肌成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)記

3、蛋白，并普遍用于鑒定組織纖維化過程中上皮細(xì)胞經(jīng)歷上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial Mesenchymal Transition，EMT）的標(biāo)志。然而，近年來，越來越多論證開始質(zhì)疑 FSP-1作為成纖維細(xì)胞標(biāo)記蛋白的特異性，而在大鼠腎間質(zhì)炎癥和小鼠腎小球腎炎模型中發(fā)現(xiàn)，大部分FSP-1+細(xì)胞表達(dá)單核細(xì)胞的標(biāo)記蛋白，這使得FSP-1用于檢測(cè)腎臟炎癥反應(yīng)中肌成纖維細(xì)胞或體內(nèi)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的實(shí)用性開始被質(zhì)疑，此外，關(guān)于FSP-1+細(xì)胞在腎纖維化

4、中的調(diào)節(jié)機(jī)制的研究也是少有開展。
　　Notch信號(hào)通路是生物進(jìn)化守恒的通路，是細(xì)胞發(fā)展、分化、存活及發(fā)揮功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，在生物基本發(fā)育進(jìn)程的細(xì)胞-細(xì)胞交流中起著至關(guān)重要的作用。本研究先是通過建立單側(cè)輸尿管梗阻（Unilateral ureteral obstruction，UUO）小鼠模型，運(yùn)用免疫組化、免疫熒光雙染技術(shù)、免疫印跡（Western blot）、RT-PCR技術(shù)，觀察FSP-1+細(xì)胞在單側(cè)輸尿管梗阻腎組織中的表達(dá)

5、情況；再通過免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)人體梗阻性腎臟病腎切除術(shù)后腎臟組織標(biāo)本中出現(xiàn)FSP-1+和CD45+細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象，初步得出和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相一致的發(fā)現(xiàn)；最后應(yīng)用GFP-STOPLoxP/LoxP/FSP-1-cre小鼠，將 FSP-1-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型（Wild Type，WT）小鼠完成骨髓移植實(shí)驗(yàn)，論證梗阻性腎臟中的FSP-1+細(xì)胞主要是骨髓源性的造血細(xì)胞，并且觀察到單側(cè)輸尿管梗阻小鼠模型中Notch通道顯著激活，探討了FSP-1+細(xì)

6、胞上Notch通道的活化對(duì)腎間質(zhì)炎癥與纖維化的影響。
　　目的:
　　1．探討單側(cè)輸尿管梗阻后小鼠腎組織中FSP-1+細(xì)胞的分類與來源。
　　2．探討Notch信號(hào)通路在FSP-1+細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及與單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎間質(zhì)炎癥和纖維化的關(guān)系。
　　方法:
　　1.（1）雄性野生型 C57BL/6小鼠60只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)分組的方法分為兩組：假手術(shù)組（Sham）和模型組(UUO)，分別于造模成功后的

7、第3天和第7天處死小鼠，其中每批每組小鼠各5只。PAS（ Periodic caid-Schiff,PAS）染色觀察各組小鼠腎臟病理形態(tài)，免疫組化法檢測(cè)FSP-1蛋白表達(dá)情況；采用小鼠靜脈注射有絲分裂標(biāo)記物---BrdU的方法，結(jié)合免疫熒光技術(shù)檢測(cè)腎間質(zhì)FSP-1+細(xì)胞增殖情況；Western blot檢測(cè)腎組織FSP-1、血小板源性生長(zhǎng)因子受體-α（Platelet-derived growth factor receptor-α,P

8、DGFR-α）、纖維連接蛋白（Fibronectin,FN）、增殖細(xì)胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen,PCNA）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）蛋白的表達(dá)情況；免疫熒光雙染技術(shù)檢測(cè)單側(cè)輸尿管梗阻小鼠模型腎組織中FSP-1+分別與α-SMA+、PDGFR-α+、 CD45+以及F4/80+細(xì)胞雙染的情況。
　?。?）應(yīng)用免疫熒光技術(shù)觀察人體梗

9、阻性腎臟病腎切除術(shù)后腎臟組織標(biāo)本FSP-1和CD45表達(dá)情況。
　　2.（1）將FSP-1啟動(dòng)子攜帶GFP表達(dá)的FSP-1-GFP報(bào)道基因小鼠應(yīng)用于單側(cè)輸尿管梗阻小鼠模型，GFP熒光染色將特異性地標(biāo)記FSP-1-GFP報(bào)道基因小鼠腎組織內(nèi) FSP-1+細(xì)胞。應(yīng)用免疫熒光雙染技術(shù)檢測(cè) GFP+與α-SMA+或PDGFR-α+共表達(dá)情況；流式細(xì)胞技術(shù)觀察FSP-1+細(xì)胞特性。
　　（2）將 FSP-1-GFP供體小鼠和野生型（W

10、T）小鼠進(jìn)行骨髓移植實(shí)驗(yàn)：將FSP-1-GFP供體小鼠的骨髓細(xì)胞移植給WT小鼠，同時(shí)將WT小鼠的骨髓細(xì)胞移植給FSP-1-GFP小鼠，之后建立單側(cè)輸尿管梗阻腎纖維化模型。應(yīng)用免疫熒光技術(shù)觀察骨髓移植后各組小鼠FSP-1+和GFP+細(xì)胞浸潤(rùn)情況。
　?。?）RT-PCR技術(shù)觀察單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎組織中兩個(gè)Notch配體（Jag1和Dll4）、四個(gè)Notch受體（Notch1-4）、Hes/Hey家族（Hes1,Hey1和Hey2）

11、三個(gè)典型 Notch靶基因以及 Notch信號(hào)轉(zhuǎn)錄抑制劑的時(shí)序性轉(zhuǎn)錄水平情況；Western blot法檢測(cè)NICD（Notch intracellular domain,NICD）和Jagged1蛋白的表達(dá)；免疫熒光雙染技術(shù)檢測(cè)FSP-1+與NICD+細(xì)胞共表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　一、單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎組織中FSP-1+細(xì)胞的分類和來源
　　1.免疫組織化學(xué)法動(dòng)態(tài)觀察單側(cè)輸尿管梗阻后小鼠腎小管-間質(zhì)中 FSP-

12、1+細(xì)胞隨時(shí)間增長(zhǎng)而數(shù)量增多，各時(shí)間點(diǎn)差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。BrdU染色結(jié)果顯示 BrdU+細(xì)胞主要表達(dá)在腎間質(zhì)區(qū)域，單側(cè)輸尿管梗阻后第7天BrdU+細(xì)胞數(shù)比第3天增多，F(xiàn)SP-1+與BrdU+雙染細(xì)胞數(shù)亦明顯增多，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與假手術(shù)組相比，Western blot法檢測(cè)顯示梗阻腎組FSP-1、PDGFR-α、FN、PCNA、α-SMA蛋白的表達(dá)上調(diào)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示梗阻腎小鼠腎組織中出現(xiàn)FS

13、P-1+細(xì)胞浸潤(rùn)及增殖的現(xiàn)象，且FSP-1+細(xì)胞是梗阻腎后腎間質(zhì)增殖的主要細(xì)胞類型。
　　2．免疫熒光細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)梗阻腎小鼠腎臟組織顯示FSP-1和PDGFR-α或α-SMA雙染陽性的細(xì)胞非常少，F(xiàn)SP-1+/α-SMA+僅占每高倍視野總細(xì)胞數(shù)的2.27%， FSP-1+/PDGFR-α+僅占高倍視野總細(xì)胞數(shù)的1.27%，但可見大約60%FSP-1+細(xì)胞表達(dá) CD45+造血細(xì)胞，同時(shí)，出現(xiàn)很大比例巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80+與F

14、SP-1+共染陽性的細(xì)胞（95.9±0.66%）。提示FSP-1+細(xì)胞可表達(dá)造血細(xì)胞的標(biāo)記蛋白，F(xiàn)SP-1+并非成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)記蛋白。
　　3.人體梗阻性腎臟病腎切除術(shù)后腎臟組織中，免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腎間質(zhì)區(qū)域FSP-1+、CD45+細(xì)胞數(shù)量較正常增多，可見FSP-1+/CD45+雙染細(xì)胞。提示人體梗阻性腎臟組織中浸潤(rùn)的FSP-1+細(xì)胞可能來源于造血細(xì)胞，初步得出和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相一致的發(fā)現(xiàn)。
　　二、Notch信號(hào)通路在 F

15、SP-1+細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及與單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎間質(zhì)炎癥和纖維化的關(guān)系
　　1.利用 FSP-1-GFP報(bào)道基因小鼠建立單側(cè)輸尿管梗阻模型，免疫熒光雙染發(fā)現(xiàn)在間質(zhì)中GFP+/α-SMA+或GFP+/PDGFR-α+共表達(dá)陽性的細(xì)胞僅占一小部分（GFP+/α-SMA+：3.89%，GFP+/PDGFRα+：5.4%）；分離假手術(shù)組及梗阻腎組小鼠腎組織細(xì)胞，采用流式細(xì)胞技術(shù)分析、分選細(xì)胞，結(jié)果顯示單側(cè)輸尿管梗阻后第7天腎組織中 FSP-

16、1+細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，且大部分為造血細(xì)胞（約60%FSP-1+細(xì)胞為CD45+細(xì)胞，F(xiàn)SP-1+/F4/80+巨噬細(xì)胞和FSP-1+/CD3+淋巴細(xì)胞數(shù)量也顯著增加）；而 FSP-1+/α-SMA+共表達(dá)的肌成纖維細(xì)胞僅僅占2.5%。以上結(jié)果提示 FSP-1+并非成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)記蛋白，F(xiàn)SP-1+細(xì)胞主要為骨髓源性的造血細(xì)胞。
　　2.骨髓移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示將WT小鼠骨髓移植到FSP-1-GFP小鼠，單側(cè)輸尿管梗阻后小鼠腎組

17、織中絕大多數(shù)間質(zhì)浸潤(rùn)的細(xì)胞為 FSP-1+/GFP-，個(gè)別為FSP-1+/GFP+雙染陽性細(xì)胞；反之，將FSP-1-GFP供體小鼠骨髓移植到WT小鼠，梗阻腎組織中>95% FSP-1+細(xì)胞是GFP+細(xì)胞。
　　3. RT-PCR檢測(cè)顯示與正常對(duì)照組相比，單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎組織中四個(gè)Notch受體蛋白（Notch1-4）、兩個(gè)配體（Jag1和Dll4）的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均明顯上調(diào)，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Weste

18、rn blot檢測(cè)顯示梗阻腎小鼠腎組織中Jagged1和NICD表達(dá)上調(diào)。以上結(jié)果顯示單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎組織中Notch通道激活，單側(cè)輸尿管梗阻造模損傷后Notch信號(hào)在FSP-1+細(xì)胞被活化。免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)單側(cè)輸尿管梗阻后小鼠第7天腎組織FSP-1與NICD雙染陽性的細(xì)胞數(shù)明顯增多。
　　結(jié)論：?jiǎn)蝹?cè)輸尿管梗阻小鼠模型中間質(zhì)浸潤(rùn)的FSP-1+細(xì)胞主要來源于骨髓-單核巨噬細(xì)胞系；梗阻腎組織內(nèi)FSP-1+單核/巨噬細(xì)胞中Notch