B族Ⅰ型清道夫受體在乳腺癌中的表達(dá)及意義.pdf

1、乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一。近年來，在中國尤其是在大型城市，乳腺癌發(fā)病率不斷攀升，嚴(yán)重影響女性身心健康。乳腺癌與遺傳、年齡、內(nèi)外源性雌激素增多等多種因素相關(guān)，但其確切病因和發(fā)病機(jī)制目前尚無定論。深入探討乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子改變，對患者的預(yù)后及治療具有十分重要的意義。
　　B族Ⅰ型清道夫受體(Scavenger receptor class BtypeⅠ，SR-BⅠ)是清道夫受體家族的一員，位于細(xì)胞膜caveolae內(nèi)，作

2、為高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)受體參與HDL介導(dǎo)的膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程。隨著近幾年脂代謝在癌癥發(fā)病過程中的作用逐漸成為研究熱點(diǎn)，已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)SR-BⅠ表達(dá)于多種腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系中，但是關(guān)于SR-BⅠ在人體乳腺癌組織中的表達(dá)情況、SR-BⅠ表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性以及SR-BⅠ在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用知之甚少。乳腺癌的組織學(xué)類型包括導(dǎo)管癌、小葉癌、粘液腺癌、腺樣囊性癌等，其中以導(dǎo)管癌

3、最為常見，占全部乳腺癌的70％-80％。因此在本課題中，我們針對SR-BⅠ在人體乳腺浸潤性導(dǎo)管癌(Invasive ductal carcinoma，IDCA)及乳腺導(dǎo)管原位癌(Ductal carcinoma in situ，DCIS)組織中的表達(dá)、SR-BⅠ與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性及其在乳腺癌腫瘤細(xì)胞中的作用進(jìn)行了探討。
　　目的：
　　研究B族Ⅰ型清道夫受體SR-BⅠ在乳腺癌中的表達(dá)規(guī)律，分析SR-BⅠ表達(dá)與乳腺癌

4、臨床病理特征的相關(guān)性及其與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系，探討其對乳腺癌診斷、預(yù)后和靶向治療的意義。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染SR-BⅠ小干擾RNA(Small interference RNA，siRNA)敲低乳腺癌細(xì)胞株MCF7和MDA-MB-231中SR-BⅠ表達(dá)，分析SR-BⅠ在乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、凋亡中的作用，探討SR-BⅠ基因?qū)π盘柾繁磉_(dá)的調(diào)控機(jī)制，為深入研究SR-BI對乳腺癌的作用提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1、收集濟(jì)南市第四

5、人民醫(yī)院病理科2008年6月至2010年12月期間乳腺導(dǎo)管癌組織蠟塊共250例作為研究對象，其中浸潤性導(dǎo)管癌200例，導(dǎo)管原位癌50例，同時(shí)隨機(jī)抽取30例癌旁正常乳腺組織作為對照。所用病例均經(jīng)兩名資深病理醫(yī)師雙盲復(fù)審閱片，證實(shí)病理診斷及組織學(xué)分級準(zhǔn)確可靠。
　　2、采用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)兩步法檢測SR-BⅠ在浸潤性導(dǎo)管癌、導(dǎo)管原位癌及癌旁正常乳腺組織中的表達(dá)情況。由兩名病理醫(yī)師閱片，并

6、根據(jù)設(shè)定的免疫組化染色判讀標(biāo)準(zhǔn)給出染色陰性或陽性的結(jié)果。統(tǒng)計(jì)分析SR-BⅠ在浸潤性導(dǎo)管癌、導(dǎo)管原位癌和癌旁正常乳腺組織中的表達(dá)差異。
　　3、調(diào)閱200例浸潤性導(dǎo)管癌患者病歷資料，收集其臨床病理指標(biāo)，包括年齡、病理分級、pTNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER及PR表達(dá)情況，電話隨訪病人生存期等信息。利用X2檢驗(yàn)分析SR-BⅠ表達(dá)和患者臨床病理指標(biāo)之間的相關(guān)性，Kalpan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank時(shí)序檢驗(yàn)進(jìn)行生

7、存率的比較，使用Cox單因素和多因素分析進(jìn)一步明確SR-BⅠ是否為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的獨(dú)立預(yù)后因素，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院乳腺癌手術(shù)新鮮癌組織標(biāo)本共30例，其中23例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌，7例乳腺導(dǎo)管原位癌，同時(shí)收集20例癌旁無瘤組織作為對照。Western Blot法檢測SR-BⅠ基因在30例乳腺癌及正常對照中的表達(dá)，X2檢驗(yàn)分析表達(dá)差異。
　　5、以乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231及M

8、CF7為體外研究模型，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染SR-BⅠsiRNA敲低MDA-MB-231及MCF7中SR-BⅠ表達(dá)。使用熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，Q-PCR)和Western Blot法檢測表達(dá)情況。
　　6、CCK8法檢測敲低SR-BⅠ后對乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響。將轉(zhuǎn)染24h后的細(xì)胞接種到96孔板中，每隔24h使用CCK8法測一次OD值，比較各組間細(xì)胞增殖的差異。
　　7、平板克隆實(shí)驗(yàn)觀察

9、敲低SR-BⅠ后乳腺癌細(xì)胞克隆形成能力的變化。將轉(zhuǎn)染后的實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞分別接種到60mm的培養(yǎng)皿中定期觀察，形成肉眼可見的克隆時(shí)固定染色并拍照觀察計(jì)數(shù)，比較各組克隆形成的大小和數(shù)目。
　　8、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測敲低SR-BⅠ后對乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響。乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-SR-BⅠ后，待細(xì)胞密度達(dá)到100％時(shí)，使用黃色槍頭在做好標(biāo)記的孔板上畫線，PBS洗去細(xì)胞碎片，更換成低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔6-12h拍照一次，統(tǒng)計(jì)軟件分析各

10、組細(xì)胞遷移能力的差異。
　　9、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測敲低SR-BⅠ后對乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后消化，使用無血清培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液100μl加入transwell小室的上室，并在下室加入600μl含10％胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液，過夜培養(yǎng)。拍照計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，評價(jià)細(xì)胞的侵襲能力。
　　10、流式細(xì)胞術(shù)檢測敲低SR-BⅠ的表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞凋亡能力的影響。乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，更換成無血清培

11、養(yǎng)基饑餓處理細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡，AnnexinⅤ-PI法染色后使用流式細(xì)胞儀檢測各組間凋亡細(xì)胞比例。
　　11、Western Blot法檢測敲低SR-BⅠ后對凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、活化Caspase3表達(dá)的影響，以及敲低SR-BⅠ后對PI3K/AKT信號通路和ERK信號通路等其他信號通絡(luò)的影響。
　　結(jié)果:
　　1、SR-BⅠ蛋白在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中表達(dá)增高
　　2、SR-BⅠ表達(dá)與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者臨床

12、病理指標(biāo)的關(guān)系
　　臨床病理分析發(fā)現(xiàn)SR-BⅠ表達(dá)和病理分級、pTNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與年齡及ER、PR的表達(dá)程度無關(guān)。
　　3、SR-BⅠ表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性
　　Kalpan-Meier法及Log-rank時(shí)序檢驗(yàn)結(jié)果顯示SR-BⅠ陽性表達(dá)患者總體生存時(shí)間較陰性表達(dá)患者短，SR-BⅠ陽性表達(dá)與患者總體生率下降相關(guān);其他預(yù)后不良因素包括年齡、病理分級、pTNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及ER缺失均與患者總體生

13、存率相關(guān)。Cox單因素生存分析結(jié)果顯示，SR-BⅠ陽性表達(dá)、年齡、病理分級、pTNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及ER缺失均會影響患者總體生存期。Cox多因素生存分析結(jié)果顯示，病理分級、SR-BⅠ陽性表達(dá)是影響乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　4、SR-BⅠsiRNA轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞后，在mRNA和蛋白水平抑制SR-BⅠ表達(dá)
　　5、SR-BⅠ在乳腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能研究
　　(1)敲低SR-BⅠ表達(dá)能抑制乳腺癌細(xì)胞的

14、增殖和克隆形成
　　(2)敲低SR-BⅠ的表達(dá)能抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移能力
　　劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:敲低SR-BⅠ的表達(dá)之后，在48h時(shí)，si-SR-BⅠ組劃痕遠(yuǎn)大于對照組，結(jié)果差異顯著(P＜0.05)，MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力均受到顯著抑制。
　　(3)敲低SR-BⅠ的表達(dá)能抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力
　　Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:與對照組比較，敲低SR-BⅠ后MCF7和MDA-MB

15、-231的穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)較少，細(xì)胞的侵襲能力降低，差異顯著(P＜0.05)。
　　(4)敲低SR-BⅠ的表達(dá)能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡
　　流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明:與對照組比較，沉默SR-BⅠ后MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞凋亡比例明顯增加，差異顯著(P＜0.05)。同時(shí)，使用Western Blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低SR-BⅠ的表達(dá)后，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量顯著下降，促凋亡蛋白Bax、活化ca

16、spase3表達(dá)量則相應(yīng)的增高。
　　6、敲低SR-BⅠ的表達(dá)對PI3K/AKT信號通路的影響
　　敲低SR-BⅠ后可以抑制PI3K/AKT信號通路的激活，作為PI3K/AKT信號通路開關(guān)分子的抑癌基因PTEN被激活，AKT、mTOR的磷酸化水平下降，下游的靶基因CyclinD1和P70的表達(dá)量也相應(yīng)下降。
　　7、其他信號通路
　　與對照組相比，敲低SR-BⅠ后可以抑制ERK信號通路的激活，ERK的磷酸化（p-

17、ERK）受到抑制。同時(shí)抑癌基因P53的表達(dá)量也相應(yīng)的減少。ER的表達(dá)未有明顯的變化。
　　結(jié)論:
　　1、人乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中SR-BⅠ表達(dá)明顯增高，其表達(dá)與病理分級、pTNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān);SR-BⅠ陽性表達(dá)與患者總體生存率下降相關(guān)，是影響浸潤性導(dǎo)管癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。SR-BⅠ作為一個(gè)新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)記物，可能和乳腺癌的進(jìn)展及患者的預(yù)后高度相關(guān)，有望成為乳腺癌的預(yù)后指標(biāo)和分子治療靶點(diǎn)。
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