清道夫受體B2蛋白的原核表達(dá)及其產(chǎn)物的活性鑒定.pdf

1、研究背景：
　　手足口病（Hand，F(xiàn)oot and Mouth Disease，HFMD）是兒童常見(jiàn)的傳染病之一。引起該病的腸道病毒以腸道病毒71型（Enterovirus71，EV71)和柯薩奇病毒A組16型（Coxsackievirus Al6，CoxA16）最為常見(jiàn)。CoxA16病毒所致HFMD癥狀相對(duì)較輕，一般不合并嚴(yán)重的并發(fā)癥，疾病過(guò)程多為自限性。EV7引起的HFMD則較為嚴(yán)重，可以導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)性疾病如急性肺水腫、急

2、性遲緩性麻痹等。
　　近年來(lái)，手足口病在世界各地均有流行，東南亞、中國(guó)臺(tái)灣及我國(guó)大部分省份也有流行，且呈上升趨勢(shì)。目前，針對(duì)EV71感染的細(xì)胞受體和宿主因子已獲識(shí)別，但多種證據(jù)表明：清道夫受體B2（Scavenger receptor class B member2，SCARB2）在EV71的感染和致病中起關(guān)鍵作用。
　　清道夫受體B2是葡萄糖腦苷酯酶的一種特異結(jié)合配體，是內(nèi)吞高密度脂蛋白和致病細(xì)菌內(nèi)攝的一種膜蛋白，歸屬于清

3、道夫受體B類亞科家族，該亞科包括SCARB1和SCARB2，SCARB2是一個(gè)相對(duì)分子量為85kDa的Ⅲ型跨膜的唾液酸糖蛋白。人scarb2基因位于第4號(hào)常染色體上，編碼一個(gè)含478個(gè)氨基酸前體的肽鏈，研究表明SCARB2主要位于溶酶體和內(nèi)涵體上并參與膜運(yùn)輸和內(nèi)涵，目前有報(bào)道 SCARB2亦廣泛存在于細(xì)胞膜上，參與 EV71感染與致病過(guò)程；另外SCARB2也可作為CoxA16的受體，與CoxA16引起的手足口病密切相關(guān)。由于目前尚無(wú)有效

4、治療手足口病的抗病毒藥物，臨床只能對(duì)癥治療。因而研制安全有效的疫苗、以及抗病毒藥物對(duì)于防治手足口病，特別是EV71引起的手足口病意義重大。本研究建立了清道夫受體B2蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)，并對(duì)該蛋白進(jìn)行了表達(dá)產(chǎn)物和免疫原性鑒定，為EV71疫苗和抗病毒藥物的研究提供了可供選擇的靶點(diǎn)。
　　研究目的：
　　用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)清道夫受體B2蛋白，并進(jìn)一步鑒定表達(dá)產(chǎn)物及其免疫原性，為EV71疫苗和抗病毒藥物的研究提供選擇靶點(diǎn)。
　

5、　研究方法：
　　1、培養(yǎng) RD細(xì)胞：復(fù)蘇人橫紋膈肌肉瘤細(xì)胞（RD細(xì)胞），購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，將細(xì)胞用5ml含10％胎牛血清、1%雙抗的完全DMEM培養(yǎng)基于37℃，5% CO2二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2、RD細(xì)胞總RNA的抽提和PCR擴(kuò)增：用寶生生物工程有限公司RNA抽提試劑盒，依照說(shuō)明書從培養(yǎng)的RD細(xì)胞中抽提總RNA，利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)清道夫受體B2的引物，反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增用寶生生物

6、工程（大連）有限公司的RNA LA PCR Kit（AMV）Ver.1.1進(jìn)行。
　　3、目的基因與表達(dá)載體的連接：將目的基因scarb2與表達(dá)載體pET28a（+）連接，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 BL21（DE3）大腸桿菌宿主，用異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)。
　　4、表達(dá)蛋白的鑒定與純化：表達(dá)的重組蛋白SCARB2用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行初步鑒定，符合目的蛋白大小后用His單抗及蛋白質(zhì)譜分析進(jìn)一步對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行鑒定，用切膠回收的方

7、法純化重組蛋白。
　　5、表達(dá)蛋白的活性鑒定：用純化的重組蛋白SCARB2分別與EV71病毒和表達(dá)的VP1蛋白進(jìn)行ELISA反應(yīng)，驗(yàn)證表達(dá)蛋白的活性。
　　6、表達(dá)蛋白免疫BALB/c小鼠：用純化的重組蛋白SCARB2免疫BALB/c小鼠，ELISA檢測(cè)免疫鼠血清抗體滴度，蛋白免疫印跡（Western Blot）驗(yàn)證重組蛋白SCARB2的抗原性。
　　7、體外中和實(shí)驗(yàn)：取目的蛋白免疫的小鼠血清，56℃、30min滅活補(bǔ)

8、體后與96孔板中的RD細(xì)胞在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中反應(yīng)2h，加入200TCID50 EV71病毒，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天后觀察免疫的小鼠血清有無(wú)中和EV71病毒的作用。
　　研究結(jié)果：
　　1、將RD細(xì)胞中抽提的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用特異性引物擴(kuò)增出1500bp大小的scarb2基因。
　　2、成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a（+）-SCARB2，將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）大腸桿菌宿主后，成功表達(dá)重組SC

9、ARB2蛋白，其分子量約為55kDa。
　　3、重組SCARB2蛋白的鑒定：重組SCARB2蛋白與His單抗反應(yīng)結(jié)果呈陽(yáng)性。蛋白質(zhì)譜分析顯示，表達(dá)的重組蛋白為SCARB2蛋白。
　　4、重組SCARB2蛋白成功免疫BALB/c小鼠，Western Blot證實(shí)其具有良好的抗原性。
　　5、體外中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：表達(dá)的重組 SCARB2蛋白免疫小鼠后，其血清具有中和EV71病毒的作用，中和抗體的滴度為1:256。