CRIF1通過PKC-δ-NRF2信號通路調(diào)控BMMSCs輻射后的氧化應(yīng)激.pdf

1、目的：
　　為深入了解CRIF1對于NRF2的具體調(diào)控關(guān)系，以及二者在BMMSCs輻射后氧化應(yīng)激調(diào)控中的分子機(jī)制，本研究應(yīng)用體外分離培養(yǎng)人BMMSCs的輻射損傷模型以及Nrf2-/-敲基因小鼠模型，對CRIF1調(diào)控BMMSCs輻射后氧化應(yīng)激的重要作用進(jìn)行了研究，并進(jìn)一步探討了CRIF1調(diào)控NRF2信號通路的的分子機(jī)制。
　　材料與方法:
　　1.通過密度梯度離心法分離并培養(yǎng)原代人骨髓BMMSCs，并對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行間充質(zhì)

2、干細(xì)胞特征鑒定;骨髓樣本來自健康的知情同意捐贈(zèng)者;
　　2.由于9Gy劑量輻射通常是出現(xiàn)h-ARS的劑量上限，故本研究采用9Gy Co-60對BMMSCs進(jìn)行輻射，輻射劑量率為700 cGy/min;而小鼠的輻射耐受小于人體，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Nrf2-/-基因敲除小鼠采用5 Gy Co-60的全身照射(TBI)，輻射劑量率同上;
　　3.Crif1 shRNA（或?qū)φ湛詹《据d體）慢病毒載體轉(zhuǎn)染BMMSCs，降低BMMSCs中的

3、CRIF1的蛋白表達(dá)水平;
　　4.免疫印跡法檢測BMMSCs輻射前后目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平變化情況;
　　5.提取細(xì)胞總RNA后合成cDNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測BMMSCs中目標(biāo)基因的mRNA相對表達(dá)水平;
　　6.應(yīng)用細(xì)胞免疫化學(xué)法和激光共聚焦顯微鏡觀測BMMSCs輻射前后CRIF1和NRF2的亞細(xì)胞定位變化情況;
　　7.應(yīng)用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測BMMSCs中的CRIF1和PKC-δ兩種蛋白之間是否有相

4、互作用;
　　8.Annexin-Ⅴ/PI染色后流式細(xì)胞儀檢測分析BMMSCs輻射前后的細(xì)胞凋亡情況;
　　9.SA-β-gal染色檢測BMMSCs輻射前后的細(xì)胞衰老情況;
　　結(jié)果:
　　1.BMMSCs輻射后氧化應(yīng)激程度增加，并誘導(dǎo)后續(xù)的細(xì)胞衰老。
　　1.1 BMMSCs在9 Gy輻射后，胞內(nèi)ROS水平立即增加，在4h達(dá)到峰值，24 h時(shí)有一定程度的恢復(fù)，但仍高于靜息水平;同時(shí)，BMMSCs中的谷胱甘

5、肽(GSH)含量在輻射后也顯著升高，表明BMMSCs在輻射后早期階段的氧化應(yīng)激顯著增加;
　　1.2 9 Gy輻射后，BMMSCs凋亡細(xì)胞比例僅從8.29％上升到9.45％，表明BMMSCs具有相對較強(qiáng)的抗放射性;
　　1.3 SA-β-gal染色顯示9 Gy輻射后72 h，BMMSCs細(xì)胞衰老程度顯著增加;細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白RB、p53和p21在輻射后48 h和72 h使均顯著增加。這些結(jié)果表明，9Gy輻射可能誘導(dǎo)BMMSC

6、s的細(xì)胞衰老;
　　2.慢病毒干擾載體降低CRIF1的表達(dá)，將加劇BMMSCs輻射后的氧化應(yīng)激程度
　　2.1 干擾CRIF1細(xì)胞輻射后，胞內(nèi)ROS水平幾乎在所有時(shí)間點(diǎn)均高于對照組，特別是在4h時(shí)，而且24 h后仍顯著高于靜息態(tài)水平;干擾組細(xì)胞的GSH含量在輻射后較對照組細(xì)胞升高更加顯著;
　　2.2 干擾CRIF1細(xì)胞在輻射后48 h時(shí)，細(xì)胞凋亡率較對照細(xì)胞顯著增加;
　　2.3 在輻射后72 h時(shí)，干擾組細(xì)胞

7、的細(xì)胞衰老程度較對照細(xì)胞顯著增加，而且，干擾組細(xì)胞的衰老相關(guān)蛋白RB、p53和p21表達(dá)較對照組顯著增加，但p16無顯著變化。
　　3.輻射改變NRF2和CRIF1蛋白的亞細(xì)胞定位，誘導(dǎo)二者轉(zhuǎn)位入核并共定位，并使其蛋白水平升高
　　3.1 在輻射后早期，NRF2蛋白水平顯著增加，在4-8 h時(shí)最高，隨后開始下降，至12h時(shí)恢復(fù)到靜息態(tài)甚至更低的水平;而CRIF1蛋白水平在輻射早期升高后，并沒有出現(xiàn)明顯的減少，到24 h時(shí)仍高

8、于靜息態(tài)水平;
　　3.2 NRF2下游目標(biāo)基因Gclc和Ggt1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，在輻射后BMMSCs中均呈現(xiàn)出與NRF2相似的趨勢，即輻射后早期升高;
　　3.3 由于NRF2轉(zhuǎn)位入核是其轉(zhuǎn)錄激活下游靶基因的關(guān)鍵步驟，因此，我們檢測了BMMSCs輻射后4h時(shí)NRF2的轉(zhuǎn)位入核情況。首先，分別提取細(xì)胞漿蛋白和核蛋白，WB實(shí)驗(yàn)檢測輻射前后NRF2在胞漿和胞核中的蛋白變化;再應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀

9、察NRF2和CRIF1的亞細(xì)胞定位情況。二者結(jié)果均顯示，NRF2和CRIF1在BMMSCs輻射后4h時(shí)轉(zhuǎn)位入核均顯著增加。另外我們還發(fā)現(xiàn)，NRF2和CRIF1轉(zhuǎn)位入核后，在核內(nèi)出現(xiàn)共定位的現(xiàn)象。這些數(shù)據(jù)提示，CRIF1可能參與了細(xì)胞輻射后NRF2的核轉(zhuǎn)位調(diào)控。
　　4.干擾CRIF1表達(dá)，BMMSCs輻射后NRF2蛋白升高程度和核轉(zhuǎn)位均受到抑制
　　4.1 干擾CRIF1表達(dá)后，BMMSCs中的NRF2蛋白含量顯著降低，而N

10、RF2的相對mRNA表達(dá)卻沒有明顯改變，這表明干擾CRIF1表達(dá)僅在蛋白水平影響了NRF2的含量;
　　4.2 對細(xì)胞進(jìn)行輻射后，干擾組細(xì)胞的NRF2蛋白水平在輻射后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)幾乎都低于對照組細(xì)胞，而且，我們還觀察到，干擾組細(xì)胞的NRF2蛋白水平在輻射后到達(dá)峰值的時(shí)間(4h)早于對照組細(xì)胞(8h)，但峰值的蛋白水平卻低于對照細(xì)胞。這些結(jié)果提示，干擾CRIF1可能降低了NRF2的蛋白穩(wěn)定性，降低了其在輻射后的升高程度;
　　4

11、.3 我們檢測了干擾CRIF1后NRF2在輻射后的入核情況。WB實(shí)驗(yàn)檢測輻射后8h時(shí)胞漿和胞核中NRF2的蛋白量變化，細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察輻射后8h時(shí)NRF2和CRIF1在BMMSCs中的亞細(xì)胞定位變化情況。結(jié)果顯示，干擾組細(xì)胞在輻射后8h時(shí)，NRF2的核內(nèi)蛋白水平和入核聚集程度均顯著低于對照組細(xì)胞;
　　4.4 我們隨后檢測了NRF2下游靶基因Ho1，Ggt1和Gclc的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平，其結(jié)果與NRF2的變化趨勢

12、基本一致，即干擾CRIF1組細(xì)胞的Ho1, Ggt1和Gclc mRNA相對表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平，在輻射后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均低于對照組。因此，我們推斷，CRIF1可能通過影響輻射后NRF2的轉(zhuǎn)位入核，來調(diào)控BMMSCs輻射的氧化應(yīng)激;
　　4.5 我們應(yīng)用Nrf2-/-敲基因小鼠的5Gy TBI模型，在體內(nèi)驗(yàn)證CRIF1和NRF2之間的調(diào)控關(guān)系。首先，Nrf2-/-敲基因小鼠輻射后BMMSCs的數(shù)量較野生型有所減少，而ROS水平較野

13、生型升得更高，這表明NRF2對輻射后的BMMSCs具有重要的保護(hù)作用，失去NRF2的抗氧化作用，輻射產(chǎn)生的高水平ROS將加速細(xì)胞的死亡;其次，通過間接熒光法我們發(fā)現(xiàn)，無論NRF2敲除與否，小鼠輻射后其BMMSCs中CRIF1蛋白水平均出現(xiàn)相似程度的增加，這就表明，NRF2并非CRIF1的蛋白調(diào)控因子，而是CRIF1調(diào)控NRF2的蛋白水平。
　　5.CRIF1共激活PKC-δ磷酸化NRF2 Ser40
　　5.1 PKC-δ磷

14、酸化NRF2 Ser40是NRF2與KEAP1解離并轉(zhuǎn)位入核的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制。因?yàn)橹暗慕Y(jié)果表明，CRIF1可能影響NRF2輻射后的核轉(zhuǎn)位，因此，我們推測CRIF1可能影響了NRF2 Ser40的磷酸化水平而導(dǎo)致后者的亞細(xì)胞定位改變。為證實(shí)這一假說，我們首先檢測了BMMSCs中NRF2 Ser40的磷酸化水平。結(jié)果顯示，在靜息條件下，干擾CRIF1的BMMSCs中NRF2 Ser40磷酸化水平顯著降低。隨后我們又檢測了輻射后NRF2 Se

15、t40磷酸化的變化，結(jié)果表明，干擾組細(xì)胞的NRF2 Ser40磷酸化水平在輻射后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著低于對照組;
　　5.2 之前的結(jié)果提示，CRIF1可能影響了NRF2 Ser40的磷酸化水平，因此，我們進(jìn)一步推測，CRIF1可能影響了PKC-δ的磷酸酶活性。首先我們檢測了CRIF1與PKC-δ的交互作用，Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，二者之間可能存在胞內(nèi)交互作用。這就提示我們，CRIF1可能通過與PKC-δ直接作用來影響后者的磷酸化活

16、性;
　　5.3 為證實(shí)CRIF1對于PKC-δ磷酸化活性影響，我們使用了三種不同效能的PKC激活劑來處理BMMSCs。結(jié)果顯示，在這三種PKC激動(dòng)劑的作用下，CRIF1干擾細(xì)胞的NRF2 Ser40磷酸化水平的升高程度均顯著低于對照組細(xì)胞。我們還檢測了NRF2的下游蛋白HO1的表達(dá)，結(jié)果與之一致，即PKC激動(dòng)劑處理細(xì)胞后，CRIF1干擾細(xì)胞的HO1升高程度均顯著低于對照組細(xì)胞。這就表明，CRIF1是PKC-δ磷酸化NRF2 Se

17、r40的共激活因子，促進(jìn)NRF2核轉(zhuǎn)位后轉(zhuǎn)錄激活下游蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.BMMSCs在9Gy輻射后，氧化應(yīng)激增加，胞內(nèi)ROS水平和GSH含量顯著升高;細(xì)胞衰老顯著增加，但細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡變化不明顯;輻射后72 h，衰老相關(guān)蛋白RB、p53和p21表達(dá)上升，但p16的變化不明顯;
　　2.干擾CRIF1表達(dá)，BMMSCs在9Gy輻射后，氧化應(yīng)激較對照組增加;細(xì)胞凋亡和細(xì)胞衰老均較對照組增加;輻射后72 h，