JNK1與TIPE2在感染后膈肌無力發(fā)生中調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、背景：在人體與呼吸有關(guān)的呼吸肌中，膈?。?diaphragm）是最重要的，呼吸肌功能的60％~80%都是由膈肌完成的，所以膈肌對于維持生物體的呼吸功能具有不可替代的作用。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體在受到病毒、細(xì)菌等引起的感染時(shí)會(huì)引起膈肌收縮功能障礙，出現(xiàn)無力現(xiàn)象，但是對于該現(xiàn)象的機(jī)制一直沒有研究清楚。臨床上造成感染的可能原因比較廣泛復(fù)雜，比如胸腹部感染，敗血癥和感染性休克等，我們課題組一直從事于膈肌無力機(jī)制的研究，對于LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥型大鼠中

2、膈肌功能障礙研究具有一定前期基礎(chǔ)，對于其相關(guān)發(fā)生機(jī)制的研究是本實(shí)驗(yàn)的主要目的。根據(jù)本組之前研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)JNK1通路在膈肌無力的發(fā)病過程中具有明顯作用，據(jù)此本實(shí)驗(yàn)利用LPS（Lipopolysaccharide）作用于大鼠造成感染，構(gòu)建大鼠膈肌肌無力模型，研究LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥大鼠中可能導(dǎo)致膈肌功能障礙的有關(guān)蛋白的表達(dá)及其變化情況，同時(shí)腹腔注射SP600125（JNK1抑制劑），觀測JNK1通路被抑制之后，大鼠膈肌的有關(guān)功能是否得

3、到保護(hù)，大鼠膈肌的收縮功能是否得到某種程度上的恢復(fù)。TIPE2作為免疫負(fù)調(diào)控因子在炎癥的過程中起到非常重要的作用，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)對TIPE2等基因做了檢測，以期闡明JNK1通路中有關(guān)蛋白的表達(dá)情況以及TIPE2基因在膈肌無力中起到的作用。
　　目的：構(gòu)建內(nèi)毒素血癥大鼠膈肌無力模型，研究JNK1通路有關(guān)蛋白以及TIPE2基因在膈肌無力中的作用，同時(shí)構(gòu)建小鼠骨骼肌細(xì)胞C2C12細(xì)胞LPS感染模型，進(jìn)一步研究JNK1通路的有關(guān)調(diào)控機(jī)制。

4、r>　　方法：雄性SD大鼠40只，精神狀態(tài)良好，體重180~220g，用隨機(jī)分組的方法分為對照組、LPS模型組以及LPS+SP600125（JNK1抑制劑）組。給藥方法：對照組的10只大鼠給予腹腔注射生理鹽水；LPS組15只，腹腔(i.p)注射LPS（12mg/kg）；LPS+SP600125組15只，腹腔(i.p)注射LPS的同時(shí)給予腹腔注射SP600125（30μM/kg）所有分組處理24h后處死；另外，每組皮下注射30ml/kg的

5、生理鹽水。24h后將大鼠進(jìn)行麻醉行氣管插管，記錄呼吸功能有關(guān)參數(shù)、對動(dòng)脈血?dú)膺M(jìn)行分析并且將大鼠膈肌離體分離制備膈肌肌條分別測定單收縮張力（Pt）同時(shí)測定最大強(qiáng)直張力（Po）、進(jìn)而用MedLab信號采集系統(tǒng)收集峰值收縮時(shí)間(CT)、半舒張時(shí)間(1/2RT)、張力最大上升速率(+dT/dtmax）、張力最大下降速率(-dT/dtmax)、張力-頻率曲線(Force-frequency curve)及疲勞指數(shù)(FI)的變化，同時(shí)收集膈肌標(biāo)本用

6、于Western Bolt、RT-PCR等實(shí)驗(yàn)測定有關(guān)基因及蛋白的表達(dá)情況，并用 HE染色和免疫組化的方法觀察膈肌組織的形態(tài)變化。構(gòu)建 JNK1、TIPE2過表達(dá)和沉默質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至小鼠骨骼肌細(xì)胞C2C12感染模型中利用Western Blot、RT-PCR以進(jìn)一步探討JNK1通路、TIPE2基因在膈肌無力中的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：⑴與對照組相比，LPS組大鼠無論在潮氣量還是肺通氣量及最大肺通氣量均明顯降低(P<0.01)。L

7、PS+SP600125組與LPS組比較各值均明顯提高(P<0.01)。⑵與對照組相比，LPS組大鼠膈肌Pt、Po、+dT/dtmax、-dT/dtmax明顯降低，CT、1/2RT明顯增高（P<0.01）。LPS+SP600125組與LPS組比較，大鼠膈肌的Pt、Po、+dT/dtmax、-dT/dtmax顯著提高（P<0.01），CT、1/2RT明顯降低（P<0.01）；LPS+SP600125組與對照組比較，Pt、Po、CT、1/2R

8、T、+dT/dtmax、-dT/dtmax差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。⑶Western Blot顯示LPS組TIPE2、p-JNK的表達(dá)量明顯升高，而JNK1無明顯變化，LPS+SP600125組JNK1得到抑制之后，JNK1的激活體表達(dá)降低，TIPE2的表達(dá)表達(dá)亦呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，RT-PCR得到一致結(jié)果。⑷利用HE染色方法顯示，對照組大鼠的膈肌肌纖維形狀較為規(guī)則，排列相對整齊，相比而言LPS組大鼠的膈肌肌纖維則呈現(xiàn)出走向紊亂

9、狀況，甚至斷裂溶解，間質(zhì)水腫。⑸免疫組化結(jié)果顯示TIPE2在LPS組的表達(dá)明顯高于Control組，顏色較深，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），JNK1的檢測結(jié)果顯示無明顯變化。⑹不同時(shí)間點(diǎn)的C2C12肌細(xì)胞感染模型顯示，p-JNK、TIPE2隨著LPS刺激時(shí)間的增加表達(dá)增多，24h之后表達(dá)會(huì)下降。之后又構(gòu)建JNK1、TIPE2過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至C2C12細(xì)胞，利用RT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)，兩者的表達(dá)趨勢呈正相關(guān)性，這與動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果