新型抗炎蛋白TIPE2調(diào)控CD8+T細胞功能在HBV感染中的作用.pdf

1、研究目的：
　　 乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus，HBV)感染所致的乙型肝炎是一個世界性的難題，全世界有數(shù)億人口被乙肝病毒所感染，其中每年有數(shù)十萬病人死于由此引發(fā)的相關肝臟疾病。部分乙肝病毒感染者可以通過機體較強的免疫反應將病毒完全清除，但也有部分感染者以及大多數(shù)垂直傳播所致的感染者，不能及時清除病毒，造成持續(xù)的慢性病毒感染。這種慢性感染引起的持續(xù)性肝炎不僅使被感染者身心倍受折磨，也是肝癌和肝硬化的重要誘因。因此，

2、深入研究機體抵抗HBV感染的免疫反應機制并篩選潛在的免疫治療靶點，具有重要的臨床意義和社會價值?，F(xiàn)有研究指出，乙肝病毒侵入人體后，CD8+T細胞在病毒的清除中發(fā)揮著重要的作用。CD8+T細胞能夠識別病毒多肽-MHCⅠ類分子復合體，增殖活化并分泌IFN-γ、TNF-α等細胞因子，釋放顆粒酶、穿孔素等，同時增強FasL的表達，通過這些途徑作用于病毒感染細胞，抑制病毒復制或引起病毒感染細胞的凋亡或裂解，最終達到清除病毒的目的。盡管CD8+T細

3、胞在HBV感染過程中的免疫防御功能已經(jīng)比較清楚，但是關于其在HBV感染的特定疾病環(huán)境下細胞行為調(diào)控尚待探討，深入這一領域研究并基于此開發(fā)CD8+T細胞功能人為干預技術可能是免疫治療HBV感染的一個突破口。
　　 TIPE2(Tumornecrosisfactor-alphainducedprotein8like-2,TNFAIP8L2)分子是2008年發(fā)現(xiàn)的新型抗炎蛋白，主要表達于各類淋巴組織及免疫細胞的表面。TIPE2分子通過

4、對T細胞表面受體和Toll樣受體負調(diào)控維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。本課題組前期研究證實，TIPE2基因缺陷小鼠更容易誘發(fā)HBV所致的肝臟炎癥。多數(shù)文獻報道指出，HBV感染所致的肝臟炎癥主要是由病毒特異性的CD8+T細胞對病毒感染細胞的殺傷所致。為此，本課題從小鼠模型和慢性乙肝病人外周血標本兩個方面入手，研究TIPE2分子對HBV感染過程中CD8+T細胞功能的調(diào)控作用，不僅為進一步研究HBV感染的分子機制提供實驗依據(jù)和理論

5、基礎，并且為乙肝的臨床治療提供研究方向和潛在靶點。
　　 材料方法：
　　 1.TIPE2在HBV感染小鼠模型中的研究
　　 1.1.HBV致敏小鼠脾淋巴細胞的獲取
　　 取8周齡雄性C57BL/6野生型小鼠和相同背景的TIPE2基因敲除小鼠（TIPE2-/-），腿部肌肉注射HBV表達質(zhì)粒（100μg/只），兩周后加強一次。二次免疫10天后，將小鼠處死，無菌取脾，200目銅網(wǎng)研磨制成單細胞懸液。
　

6、　 1.2.HBV致敏脾淋巴細胞體外殺傷檢測
　　 致敏脾細胞懸液與轉(zhuǎn)染HBV質(zhì)粒的Hepa(l)-6細胞以效靶比50∶1共培養(yǎng)，24h后CCK-8法檢測細胞活性。
　　 1.3.HBV致敏脾淋巴細胞的過繼轉(zhuǎn)輸
　　 致敏脾淋巴細胞懸液過繼轉(zhuǎn)輸?shù)?周齡C57BL/6背景的轉(zhuǎn)HBV全基因組小鼠體內(nèi)，48h后處死小鼠，取肝臟，HE染色觀察肝臟炎癥。
　　 2.乙型肝炎患者外周血標本檢測
　　 2.1

7、.HBV感染者外周血CD8+T細胞TIPE2分子表達檢測
　　 取健康對照和HBV感染者外周血，流式抗體胞內(nèi)標記TIPE2分子，流式細胞儀檢測HBV感染者外周血CD8+T細胞TIPE2分子的表達變化，并分析TIPE2分子表達水平與血清ALT、AST、HBVDNA載量之間的相關性，根據(jù)結(jié)果將乙肝患者分為TIPE2高水平組與低水平組，分析TIPE2表達水平對CD8+T細胞功能的影響。
　　 2.2.HBV感染者外周血CD8+

8、T細胞活化檢測
　　 取健康對照和HBV感染者外周血，流式抗體標記T細胞活化標志分子HLA-DR和CD38，流式細胞儀檢測陽性細胞的數(shù)量變化。
　　 2.3.HBV感染者外周血CD8+T細胞功能檢測
　　 取健康對照和HBV感染者外周血，無菌分離PBMC，培養(yǎng)于含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，加HBC18-27特異性肽刺激，6h后收取細胞。流式抗體標記胞內(nèi)分子perforin、GranzymeB和IFN-

9、γ，流式儀檢測陽性細胞的數(shù)目變化。
　　 2.4.HBV感染者外周血CD8+T細胞凋亡檢測
　　 分離健康對照和乙肝病毒感染者外周血單個核細胞，AnnexinV流式抗體以及抗人CD3、CD8抗體孵育，流式細胞儀檢測CD8+T細胞凋亡。
　　 2.5.HBC18-27短肽對健康人外周血PBMC的TIPE2分子表達的影響
　　 抽取健康人外周血于抗凝管，無菌分離PBMC，用含10％humanABserum的R

10、PMI1640培養(yǎng)基調(diào)細胞密度至6×105/ml，加終濃度為10μg/mlHBc18-27短肽和終濃度30U/mlhrIL-2，于37℃5％CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每三天補加一次hrIL-2（終濃度30U/ml），10天后收集懸浮細胞，提取mRNA反轉(zhuǎn)錄出cDNA，實時定量PCR檢測TIPE2分子表達變化。
　　 2.6.HBV感染者PBMCHBC18-27短肽誘導后殺傷能力變化
　　 抽取HBV感染者外周血，無菌分離PB

11、MC，用含10％humanABserum的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)細胞密度至6×105/ml，加終濃度為10μg/mlHBc18-27短肽和終濃度30U/mlhrIL-2，每三天補加hrIL-2（終濃度30U/ml），37℃5％CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。10天后收集懸浮細胞，與HepG2.2.15細胞共培養(yǎng)（效靶比50∶1），24h后CCK-8法檢測細胞活性。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1.TIPE2缺失的HBV致敏脾淋巴細胞

12、殺傷功能增強
　　 1.1.TIPE2基因缺失的HBV致敏脾淋巴細胞造成更嚴重的肝臟炎癥
　　 將野生型小鼠和同背景TIPE2基因缺失小鼠來源的HBV致敏脾淋巴細胞過繼轉(zhuǎn)輸?shù)紿BV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，48小時后取肝臟切片HE分析。結(jié)果顯示，HBV致敏的TIPE2基因缺失的脾淋巴細胞造成更嚴重的肝細胞的空泡化，殺傷效應明顯高于野生對照組。
　　 1.2.TIPE2基因缺失小鼠的HBV致敏脾淋巴細胞在體外能更有效的殺傷靶

13、細胞以野生型小鼠和同種系TIPE2基因缺失小鼠的HBV致敏脾淋巴細胞為效應細胞，與轉(zhuǎn)染HBV質(zhì)粒的Hepa(l)-6細胞共培養(yǎng)24小時后檢測細胞活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TIPE2基因缺失的致敏脾淋巴細胞對靶細胞（Hepa(l)-6細胞）的殺傷活性明顯高于野生對照組(WTvs.TIPE2-/-,21.33±3.18％vs.60.33±3.53％;P=0.0038)。
　　 2.乙肝病毒感染者外周血CD8+T細胞TIPE2表達降低，活化增加<

14、br>　　 2.1.乙肝病毒感染者外周血CD8+T細胞TIPE2分子表達降低
　　 健康人和乙肝患者外周血經(jīng)熒光抗體標記，流式細胞術檢測。結(jié)果顯示，乙肝患者外周血CD8+T細胞TIPE2分子表達強度明顯低于健康人（健康人外周血CD8+T細胞TIPE2表達強度vs.乙肝患者，31.32±3.57vs.19.19±1.18，P=0.0323)，且低血清ALT/AST/HBV-DNA載量組病人外周血CD8+T細胞TIPE2的表達強度

15、明顯高于高ALT/AST/HBV-DNA載量組(ALT＜47U/Lvs.ALT＞47U/L,22.33±1.26vs.15.06±1.44,P=0.0126;AST＜47U/Lvs.AST＞47U/L,22.83±0.97vs.16.69±1.44,P=0.0064;HBV-DNA＜1000vs.HBV-DNA＞1000,21.24±0.89vs.15.45±1.89,P=0.0273)。
　　 2.2.乙肝病毒感染者外周血CD

16、8+T細胞活化比例增加
　　 健康人及乙肝患者外周血全血經(jīng)T細胞活化標記分子熒光抗體染色，流式細胞術檢測，結(jié)果顯示，乙肝患者外周血CD8+T細胞表達活化分子的細胞比例明顯高于健康對照（健康人外周血CD8+T細胞活化比例vs.乙肝患者，1.56±0.38％vs.19.18±3.43％，***P＜0.001）。
　　 2.3.乙肝患者外周血CD8+T細胞殺傷功能與TIPE2表達強度呈負相關
　　 無菌抽提的健康人及乙

17、肝患者外周血單個核細胞，經(jīng)HBc18-27合成肽特異性誘導6小時后，經(jīng)熒光抗體標記并流式檢測。結(jié)果顯示，乙肝病毒感染者外周血中分泌穿孔素、顆粒酶B以及干擾素-γ的CD8+T細胞比例明顯高于健康對照（perforin:健康人vs.乙肝患者，10.96±3.29％vs.47.78±9.93％，P=0.0244;granzymB:健康人vs.乙肝患者，12.00±5.73％vs.54.50±11.37，P=0.0206;IFN-γ:健康人vs

18、.乙肝患者，0.60±0.09％vs.4.65±0.40％，P=0.0022），且乙肝患者外周血CD8+T細胞TIPE2高水平組CD8+T細胞分泌穿孔素、顆粒酶和干擾素-γ的細胞比例顯著低于TIPE2低水平組（perforin:TIPE2高表達組vs.TIPE2低表達組，33.18±3.65％vs.55.90±7.85％，P=0.039;granzymeB:TIPE2高表達組vs.TIPE2低表達組，31.90±2.89％vs.61.2

19、3±7.21％，P=0.0092;IFN-γ:TIPE2高表達組vs.TIPE2低表達組，2.70±0.52％vs.5.25±0.31％，P=0.0245）。
　　 2.4.乙肝患者外周血CD8+T細胞凋亡增加
　　 經(jīng)AnnexinV細胞凋亡試劑盒染色流式細胞術檢測，結(jié)果顯示，乙肝患者外周血CD8+T細胞凋亡比例較健康對照明顯增加(健康人vs.乙肝患者，24.13±4.13％vs.50.61±6.35％,P=0.008

20、1)。
　　 3.HBc18-27合成肽體外誘導PBMCTIPE2降低，功能增強
　　 3.1.健康人PBMC經(jīng)HBc18-27誘導TIPE2降低
　　 無菌抽提的健康人PBMC經(jīng)RPMI1640+10％ABserum培養(yǎng)，并經(jīng)終濃度10μg/mlHBc18-27合成肽及30U/mlhrIL-2刺激10天后，實時定量PCR檢測TIPE2mRNA水平，結(jié)果顯示，經(jīng)HBc18-27合成肽誘導的PBMCTIPE2mRN

21、A水平明顯低于對照組(controlvs.stimulatewithHBc18-27，1±0.04vs.0.667±0.01，P=0.0018)。
　　 3.2.乙肝患者PBMC經(jīng)HBc18-27誘導后體外殺傷活性增強
　　 無菌分離的乙肝患者PBMC經(jīng)RPMI1640+10％ABserum添加10μg/mlHBc18-27合成肽以及30U/mlhrIL-2培養(yǎng)10天后，與HepG2.2.15細胞共培養(yǎng)24h，CCK-8

22、試劑盒檢測細胞活性，結(jié)果顯示，與HBc18-27合成肽誘導的乙肝患者PBMC對靶細胞（HepG2.2.15細胞）的殺傷活性明顯高于對照組(controlvs.stimulatewithHBc18-27,1.00±0.08vs.2.28±0.05，***P＜0.001)。
　　 結(jié)論：
　　 1.TIPE2基因缺失明顯增強小鼠HBV致敏脾淋巴細胞在體內(nèi)外的特異性殺傷活性。
　　 2.HBV感染過程中CD8+T細胞T

23、IPE2分子表達的降低能促進CD8+T細胞產(chǎn)生更強的功能，從而發(fā)揮更顯著的抗病毒作用。
　　 3.乙肝病毒感染者外周血CD8+T細胞凋亡細胞比例較健康人明顯增多,有兩方面的解釋:一、機體通過及時的清除活化的細胞，避免免疫反應過于強烈而對機體造成損傷;二、活化CD8+T細胞的凋亡有可能是乙肝病毒在體內(nèi)不能被及時清除而產(chǎn)生慢性乙型肝炎的原因之一。
　　 4.本課題從小鼠模型和人外周血標本檢測兩個方面來研究TIPE2調(diào)節(jié)CD8

24、+T細胞在HBV感染中的作用，為研究的進一步深入提供了可靠的實驗依據(jù)和理論基礎，為乙型肝炎臨床治療中分子靶點的尋找提供了參考。
　　 創(chuàng)新及意義：
　　 本實驗通過小鼠模型實驗，首次證明了TIPE2基因缺失后，HBV致敏脾淋巴細胞在體內(nèi)外的殺傷功能增強。通過對乙肝病毒感染者和健康人外周血單個核細胞流式檢測以及HBc18-27合成肽誘導，首次直接證明了TIPE2分子表達的下調(diào)對患者體內(nèi)CD8+T細胞的功能有明顯的促進作用，