TIPE2在白血病細胞中新功能的研究.pdf

1、背景：
　　腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)誘導的蛋白8家族樣蛋白2(TNF-αinducedprotein8like2，TNFAIP8L2，TIPE2)蛋白被認為是一種非常關鍵的免疫調(diào)節(jié)蛋白，TIPE2基因與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切。白血病是一種發(fā)病率高，致死率高的惡性腫瘤，可引起骨髓造血干細胞的癌變，產(chǎn)生大量未分化的免疫細胞，這種類型的細胞不能發(fā)揮正常的免疫調(diào)控功能，因此就會使正常的造

2、血系統(tǒng)受到影響，最終導致白血病的發(fā)生。有報道顯示，TIPE2基因在淋巴細胞內(nèi)有高表達的現(xiàn)象，提示TIPE2基因在淋巴細胞的增殖、分化等功能中可能發(fā)揮著重要作用。近來有研究認為TIPE2與腫瘤的發(fā)病有密切關系，但是其在白血病發(fā)生、發(fā)展中的作用尚未明了。本課題收集了602例白血病伴有淋巴瘤混合發(fā)病病人的組織標本，利用基因操縱技術(shù)上調(diào)或者下調(diào)白血病細胞中TIPE2的表達，并進一步檢測了TIPE2基因?qū)Π籽〖毎脑鲋?、生長周期、細胞凋亡和遷移

3、的影響，為深入探討TIPE2在白血病發(fā)病中的具體作用機制奠定了基礎。
　　目的：
　　探討TIPE2基因?qū)Π籽〖毎鞣N生物學功能的影響，以及其影響白血病發(fā)生、發(fā)展的具體作用機制。
　　方法：
　　將TIPE2基因的CDS區(qū)全長與pCMV-C-Flag和pEGFP-N2載體重組，構(gòu)建過表達質(zhì)粒Flag-TIPE2和GFP-TIPE2，然后將重組質(zhì)粒經(jīng)電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)到白血病細胞K562中，加G418抗生素進行藥物篩選后，

4、得到穩(wěn)定的亞細胞株K562-FLAG（對照）、K562-FLAG-TIPE2、K562-GFP（對照）和K562-GFP-TIPE2，以及經(jīng)pSilence4.1-CMVneo干擾沉默后篩選得到穩(wěn)定亞細胞株K562-Si-C（對照）和K562-SiTIPE2。用RT-PCR和qPCR方法檢測TIPE2基因mRNA的表達水平。用MTT染色法進行人工計數(shù)，并作出穩(wěn)定細胞株的生長曲線圖，之后再用流式細胞術(shù)檢測細胞周期和凋亡情況。用293T作為

5、蛋白表達系統(tǒng)，用細胞免疫組化方法檢測TIPE2表達對細胞凋亡的影響。才用Transwell小室和軟瓊脂實驗來檢驗對TIPE2基因敲低和過表達的情況下，白血病細胞遷移的變化。最后，用免疫印跡雜交方法檢測TIPE2過表達后對JNK1、Caspase3、Caspase8等蛋白表達水平的影響，進一步探討TIPE2在白血病中的作用。
　　結(jié)果：
　　用免疫組化方法檢測TIPE2的表達，結(jié)果顯示白血病組織中TIPE2表達陽性率為69.3

6、％（417例）。利用基因操縱技術(shù)上調(diào)或者下調(diào)白血病K562細胞中TIPE2的表達水平，成功構(gòu)建TIPE2基因過表達重組質(zhì)粒并把其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到K562細胞中得到K562-FLAG(對照)、K562-FLAG-TIPE2、K562-GFP(對照)、K562-GFP-TIPE2、K562-Si-C（對照）和K562-SiTIPE2細胞亞克隆。過表達或者敲低白血病細胞中TIPE2后，經(jīng)流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，TIPE2對白血病細胞的周期沒有明顯影響(

7、P＞0.05);用免疫印跡雜交法和免疫組化檢測cleaved-caspase-3，cleaved-caspase-8，caspase-3，caspase-8等凋亡相關蛋白的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TIPE2能引起白血病細胞的凋亡(P＜0.05)。之后，在上調(diào)TIPE2后，經(jīng)細胞遷移實驗（Transwell小室檢測和軟瓊脂實驗檢測）發(fā)現(xiàn)K562細胞生長加快(P＜0.05)，遷移能力升高，而下調(diào)TIPE2可以使白血病細胞的生長減緩，遷移力降低(P＜