Ac-SDKP通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕纖維化模型上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)，探討特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化（IPF）病程中，Ac-SDKP通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)而干預(yù)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程而延緩肺纖維化發(fā)展的作用機(jī)制。
　　方法：
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：將24只健康雄性C57BL/6小鼠（體重25±2g）隨機(jī)分為3組：假手術(shù)對(duì)照組(N組，n=8只)、肺纖維化模型組（M組，n=8只）、肺纖維化+Ac-SDKP干預(yù)治療組（P組,n=8只）。M組及P組小鼠采用氣管內(nèi)注入博來(lái)霉素（5 m

2、g/kg，共配制成50μl混合溶液）法制備小鼠肺纖維化模型，21天后于P組小鼠腹腔內(nèi)埋入Ac-SDKP藥物微量釋放泵（內(nèi)含Ac-SDKP混合溶液：Ac-SDKP800 ug.kg-1.d-1，冰乙酸0.1 M，卡托普利100 mg.kg-1.d-1,溶液配制劑量經(jīng)查詢大量國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)而定），持續(xù)干預(yù)21天。N組造模方法同M組，氣管內(nèi)注入等體積（50μl）0.9％氯化鈉生理鹽水。N組和M組小鼠于造模完成后第21天處死，而P組小鼠于Ac-SD

3、KP干預(yù)治療后第21天處死，取肺組織，染色并觀察其病理學(xué)變化；羥脯氨酸含量測(cè)定，判斷肺纖維化模型制備是否成功并評(píng)估肺組織纖維化嚴(yán)重程度；Western Blot、免疫組化法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、CHOP，間質(zhì)組織標(biāo)志物Vimentin，上皮組織標(biāo)志物E-cadherin蛋白水平表達(dá)的變化。
　　體外實(shí)驗(yàn)：體外培養(yǎng)人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞株（A549細(xì)胞），并于無(wú)血清同步化處理24小時(shí)后給予TGF-β干預(yù)24小時(shí)，模擬體外肺纖

4、維化病理改變及EMT相關(guān)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并于給予Ac-SDKP（80 mmol/L）干預(yù)24小時(shí)后收集細(xì)胞，細(xì)胞分組如下：正常對(duì)照組（N組）、TGF-β干預(yù)組（T組）、TGF-β+Ac-SDKP干預(yù)組（T+A組）、單獨(dú)Ac-SDKP干預(yù)組（A組）。使用倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并拍照，qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中GRP78、CHOP、Vimentin、E-cadherin等指標(biāo)mRNA水平表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:

5、　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：1、肉眼觀察：N組小鼠肺組織呈淡粉色，表面及切面光滑，未見(jiàn)結(jié)節(jié)形成及明顯出血點(diǎn)；M組小鼠雙肺色澤晦暗，表面及切面均可見(jiàn)散在小結(jié)節(jié)及大小不等出血點(diǎn)；P組小鼠肺組織表面亦可見(jiàn)上述異常表現(xiàn)，但較M組小鼠變化為輕。2、HE及Masson染色：M組小鼠肺組織出現(xiàn)明顯纖維化改變。與M組相比，P組小鼠肺纖維化程度有所減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。3、羥脯氨酸含量測(cè)定（HYP）：M組小鼠肺組織HYP含量較N組明顯升高；P組較M組

6、降低，而較N組仍有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。4、免疫組化結(jié)果：（1）N組小鼠肺組織中，E-cadherin表達(dá)部位及表達(dá)量較多，M組較N組表達(dá)明顯減少，P組E-cadherin陽(yáng)性表達(dá)量居于N組與M組之間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；（2）N組小鼠肺組織中，Vimentin僅少量陽(yáng)性表達(dá)且表達(dá)范圍較小，而M組中，Vimentin的表達(dá)量較N組明顯增加且廣泛表達(dá)于肺泡細(xì)胞胞漿及肺組織間質(zhì)基質(zhì)中，P組Vimentin陽(yáng)

7、性表達(dá)量居于N組與M組之間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；（3）CHOP及GRP78廣泛表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞，且M組表達(dá)量均高于N組，而P組表達(dá)量則介于N組與M組之間（P＜0.05）。5、Western Blot結(jié)果：與N組比較， M組CHOP、GRP78、Vimentin表達(dá)量均升高；E-cadherin的表達(dá)量降低；而P組各指標(biāo)蛋白陽(yáng)性表達(dá)量均介于N組與M組之間，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。<

8、br>　　體外實(shí)驗(yàn)：1、A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：經(jīng) TGF-β干預(yù)后，細(xì)胞呈紡錘樣、成纖維細(xì)胞樣形態(tài)改變。2、qRT-PCR結(jié)果：與N組比較，M組CHOP、GRP78、Vimentin mRNA表達(dá)量均升高，E-cadherin mRNA的表達(dá)量降低，而P組各指標(biāo)mRNA表達(dá)量均介于N組與M組之間，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　在肺間質(zhì)纖維化發(fā)病過(guò)程中，Ac-SDKP可能通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)減